Überwachung im Inneren

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12529 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Campylobacter jejuni und Campylobacter coli sind wichtige lebensmittelbedingte Zoonoseerreger und geben aufgrund der zunehmenden Tendenz zur antimikrobiellen Resistenz Anlass zur Sorge. In fünf Milchviehbetrieben wurde eine Langzeitüberwachungsstudie an Tieren verschiedener Altersgruppen durchgeführt, um die Diversität und Übertragungsdynamik resistenter Campylobacter innerhalb des Betriebs im Laufe der Zeit zu untersuchen. Der Resistenzphänotyp der zirkulierenden Isolate (170 C. jejuni und 37 C. coli) wurde durch Mikroverdünnung der Brühe bestimmt und eine Auswahl von 56 Isolaten wurde mit der Langfragment-Sequenzierungstechnologie von Oxford-Nanopore im gesamten Genom sequenziert, was zu vollständig aufgelösten und zirkularisierten Genomen führte (sowohl Chromosomen als auch Plasmide). C. jejuni wurde aus allen Betrieben isoliert, während C. coli nur aus zwei Betrieben isoliert wurde, aber die Resistenzraten waren bei C. coli höher als bei C. jejuni und bei Kälbern höher als bei erwachsenen Tieren. Einige Genotypen (z. B. ST-48, gyrA_T86I/tet(O)/blaOXA-61 in Betrieb F1; ST-12000, aadE-Cc/tet(O)/blaOXA-489 in F4) blieben während der gesamten Studie bestehen, während andere nur sporadisch auftraten erkannt. Der Erwerb extrazellulärer Gene aus anderen Isolaten und intrazelluläre Mutationsereignisse wurden als die Prozesse identifiziert, die zur Entstehung resistenter Genotypen führten, die sich innerhalb der Herden ausbreiteten. Die Überwachung mit der Sequenzierung von Oxford Nanopore Technologies trug dazu bei, die komplexe molekulare Epidemiologie zu entschlüsseln, die der Verbreitung resistenter Campylobacter innerhalb des Betriebs zugrunde liegt.

Campylobacteriose ist die Hauptursache für bakterielle Gastroenteritis beim Menschen in Industrieländern, wobei die Arten Campylobacter jejuni und Campylobacter coli die Hauptverursacher sind. Nach Geflügel gelten Rinder als Hauptquelle für die Übertragung von Campylobacter auf den Menschen durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel und/oder Wasser oder durch direkten Kontakt mit den Tieren oder deren Fäkalien1. Da Campylobacter-Infektionen in der Regel selbstlimitierend verlaufen, ist eine antimikrobielle Therapie nur bei systemischen und schweren Infektionen indiziert. Dennoch geben antimikrobiell resistente Campylobacter Anlass zur Sorge, da sie die Behandlungsmöglichkeiten für Infektionen gefährden. Fluorchinolone (FQs) und Tetracycline, die oft als empirische Therapie bei Durchfall2 verschrieben werden, haben aufgrund der hohen Resistenzniveaus eine verminderte Wirksamkeit. Makrolide sind daher die antimikrobiellen Mittel der Wahl bei im Labor bestätigten Fällen schwerer Campylobacteriose3,4.

Unsere früheren Ergebnisse, die auf epidemiologischen Querschnittsstudien im Baskenland (Nordspanien) basieren, zeigten, dass Milchvieh ein wichtiges Reservoir für resistente Campylobacter5,6 darstellt und dass die Prävalenz von Resistenzen gegen medizinisch wichtige antimikrobielle Mittel wie FQs hoch ist nimmt zu, während die Resistenz gegen Makrolide gering bleibt6,7. Der Erwerb bestimmter antimikrobieller Resistenzmerkmale wurde mit einer erhöhten bakteriellen Fitness in Verbindung gebracht (z. B. die C257T-Punktmutation im gyrA-Gen)8,9, wohingegen andere zu einer Abnahme der Fitness führten (z. B. die Punktmutation 2075G im 23S-rRNA-Gen)10,11. In gewissem Maße könnte dies die derzeit beobachteten hohen FQ-Resistenzraten und die niedrigen Makrolidresistenzraten bei Campylobacter spp. erklären. aus Nutztieren12.

In mehreren Studien wurde über altersabhängige Variabilität im Kotausscheidungsmuster von Campylobacter und Unterschiede in der Persistenz verschiedener Genotypen innerhalb des Betriebs berichtet 13,14,15. Allerdings ist die Dynamik der Übertragung resistenter Genotypen innerhalb der Herde noch nicht vollständig geklärt, und es bestehen noch Lücken hinsichtlich der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen. In Anbetracht der hohen Korrelation zwischen der Resistenzinferenz basierend auf dem Phänotyp unter Verwendung minimaler Hemmkonzentrationen (MIC) und dem Genotyp unter Verwendung der Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) bei Campylobacter16 und der Leistungsfähigkeit von WGS für die eingehende genomische Charakterisierung von Bakterien17 wurde hier eine Längsschnittstudie durchgeführt über einen Zeitraum von 16 Monaten in fünf Milchviehbetrieben durchgeführt, um zu untersuchen, ob bestimmte resistente Genotypen besser an eine langfristige Herdenbesiedelung angepasst werden könnten. Phänotypische antimikrobielle Empfindlichkeitstests und WGS wurden kombiniert, um die Isolate zu charakterisieren, die von Tieren unterschiedlicher Altersgruppen (Kälber, Färsen und laktierende Kühe) im Laufe der Zeit gewonnen wurden. Um vollständige Zusammenstellungen zirkulärer Bakteriengenome und Plasmide sicherzustellen und genaue Informationen über die Position der antimikrobiellen Resistenzgene (ARGs) zu erhalten, wurde Long-Read-Sequenzierung auf Basis der Oxford Nanopore-Technologie (ONT) verwendet. Das Verständnis der komplexen Epidemiologie und Dynamik des Erwerbs und der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen bei C. jejuni und C. coli in Milchviehbetrieben würde dabei helfen, Grundlagen für Empfehlungen für betriebliche Managementpraktiken festzulegen.

Das Vorhandensein von Campylobacter spp. wurde durch Echtzeit-PCR-Analyse einer Schleife voller Bakterienwachstum auf CASA®-Platten in 98,6 % der Proben nachgewiesen, wobei 88,8 % PCR-positiv für C. jejuni, C. coli oder beide waren . Während C. jejuni in allen Betrieben isoliert wurde, wurde C. coli nur in zwei Betrieben gefunden, nämlich in F4, wo C. coli in allen Altersgruppen die vorherrschende Art war, und in F5, wo C. coli nur isoliert wurde von Kälbern, während C. jejuni in allen Altersgruppen gefunden wurde.

Insgesamt 170 C. jejuni- und 37 C. coli-Isolate aus Fäkalien (bis zu 2 Isolate pro Probenahmedatum, Altersgruppe und Art in jedem Betrieb) wurden auf antimikrobielle Empfindlichkeit getestet. Insgesamt waren die Resistenzraten bei Kälbern höher als bei Färsen und laktierenden Kühen (χ2 = 6,46, p = 0,011) (Ergänzende Abbildung S1); Tatsächlich waren alle Isolate von Kälbern gegen mindestens eine antimikrobielle Klasse resistent. Die Resistenz war bei C. coli im Vergleich zu C. jejuni weiter verbreitet (χ2 = 7,22, p = 0,007). Nur 1 C. coli-Isolat (2,7 %, 1/37) war empfindlich gegenüber allen getesteten antimikrobiellen Mitteln, verglichen mit 25 panempfindlichen C. jejuni (14,7 %, 25/170) (Abb. 1). Von den 181 Isolaten, die gegen mindestens ein antimikrobielles Mittel resistent waren, waren 155 (144 C. jejuni und 11 C. coli) sowohl gegen CIP als auch gegen NAL resistent. Somit war die FQ-Resistenz bei C. jejuni im Vergleich zu C. coli sehr hoch (84,7 % vs. 29,7 %; ORadj = 15,21 (6,79–34,09), p < 0,001) und nahm mit zunehmendem Alter ab (χ2 = 6,59, p = 0,010). ); Die Resistenz gegen TET war etwas geringer (70,0 %, 119/170) und zeigte einen ähnlichen Alterstrend (χ2 = 12,12, p = 0,002). Die Resistenz gegen STR war bei C. jejuni gering (8,2 %, 14/170), bei C. coli jedoch extrem hoch (97,3 %, 36/37), wobei sich die Werte zwischen beiden Arten deutlich unterschieden (ORadj = 416,0 (53,55–3243,82), S < 0,001). Nur in F4 war die Resistenz gegen STR unter C. jejuni-Isolaten weit verbreitet (5 der 6 resistenten C. jejuni-Isolate). Eine Resistenz gegen ERY wurde nur in 3 C. coli-Isolaten aus zwei gepoolten Proben festgestellt, die von Kälbern in F5 während zweier aufeinanderfolgender Probenahmen entnommen wurden. Alle 207 Isolate waren anfällig für GEN.

(A) Verteilung der phänotypischen antimikrobiellen Resistenzprofile (AMR) von C. jejuni- und C. coli-Isolaten in jedem Betrieb und jeder Altersgruppe (C, Kälber; H, Färsen; und LC, laktierende Kühe) während des Probenahmezeitraums. (B) Kreisdiagramme, die die relativen Häufigkeiten jedes AMR-Profils für jede Campylobacter-Art veranschaulichen. Phänotypische Profile wurden entsprechend der Legende farblich gekennzeichnet und antimikrobielle Mittel wurden wie folgt abgekürzt: Erythromycin (ERY), Ciprofloxacin (CIP), Nalidixinsäure (NAL), Streptomycin (STR) und Tetracyclin (TET).

Die unterschiedlichen Profile der mikrobiologischen Resistenz, die sich aus der Kombination von Resistenzen gegen antimikrobielle Wirkstoffe mit MHK-Werten über dem ECOFF ergeben, und ihre Verteilung innerhalb der einzelnen Betriebe sind in Abb. 1 dargestellt. Im Verlauf der Studie wurden in jedem Betrieb zwischen 2 und 4 unterschiedliche Resistenzprofile beobachtet. Die Diversität ist bei laktierenden Kühen und Färsen höher als bei Kälbern und bei F5 und F4 im Vergleich zu den anderen Betrieben. Es wurden zwei Multidrug-Resistenzprofile (MDR) (drei oder mehr Klassen antimikrobieller Wirkstoffe) identifiziert, d. und ERY-CIP-NAL-STR-TET, nur in C. coli nachgewiesen, das von Kälbern in F5 gewonnen wurde. Das Profil CIP-NAL-TET dominierte in F1, F2 und F3. In F4 waren alle bis auf ein resistentes Isolat resistent gegen STR allein oder in Kombination mit TET und CIP/NAL. In diesem Betrieb war das vorherrschende Resistenzprofil bei C. jejuni (5/6) CIP-NAL-STR-TET, während bei C. coli drei verschiedene Profile identifiziert wurden. In F5 war die Diversität trotz der geringen Anzahl gewonnener Isolate (nur 5 Proben) am höchsten und umfasste 4 C. jejuni-Profile und das MDR C. coli-Profil ERY-CIP-NAL-STR-TET bei Kälbern.

Eine Auswahl von 56 Isolaten aus F1 und F4 (eines pro Campylobacter-Art, Altersgruppe und Probenahmezeitpunkt) wurde von WGS analysiert, um das Genomprofil der in diesen Betrieben zirkulierenden Stämme gründlich zu vergleichen. Die ONT-Sequenzierung dieser Isolate ergab einen Median von 23.393 Lesevorgängen pro Probe (IQR = 19.502–29.183) bei einem Median von 302 MB pro Probe (IQR = 280–314 MB), was einer medianen Abdeckung von 157X entspricht (Q1–Q3 = 143– 165 X) (Ergänzungsdatensatz S1). Bei der Zusammenstellung ergaben 53 Isolate zirkularisierte Chromosomen. In allen Fällen entsprach die Chromosomengröße des zusammengesetzten Entwurfsgenoms der erwarteten Größe von C. jejuni (Median = 1.740.992 bp, IQR = 1.690.866–1.743.662 bp) oder C. coli (Median = 1.661.122 bp, IQR = 1.660.938–1.681.616 bp). ) und G + C-Gehalt (Median = 30,43 % bzw. 31,49 %).

Plasflow identifizierte 14 Plasmid-Contigs und weitere 12 erwiesen sich nach Abfrage mit Blastn als kompatibel als Plasmide. Diese 26 Contigs entsprachen vollständigen zirkulären Plasmiden, 21 in C. jejuni und 5 in C. coli, die einen hohen Grad an Identität mit mehreren Plasmiden aus GenBank (Supplementary Dataset S2) zeigten. ProgressiveMAUVE-Multiple-Alignments identifizierten vier verschiedene Plasmidstrukturen mit einem hohen Grad an Syntenie, von denen zwei ARGs trugen. Somit hatten ARG-tragende Plasmide in C. jejuni (18 Isolate aus F1 und 1 Isolat aus F4) eine durchschnittliche Größe von ca. 44.650 bp und waren untereinander sehr ähnlich. Insbesondere wurde ein ähnliches Tet-Plasmid in C. jejuni der Typen ST-48 und ST-19 gefunden, das in F1 zirkulierte, während das Plasmid in ST-45 (C0944) etwas kleiner (43.961 bp), aber hoch homolog war. Ein etwas größeres Plasmid (45.150 bp) wurde in einem aus F4 gewonnenen C. jejuni-Isolat (C0775) gefunden (ergänzende Abbildung S2A). Das einzige in C. jejuni-Plasmiden vorhandene Resistenzgen war tet(O). Die ARG-kodierenden Plasmide in C. coli (3 Isolate aus F4), Größe ca. 47.150 bp waren untereinander identisch und enthielten zusätzlich zum tet(O)-Gen einen Aminoglycosidcluster (Δant(6)-Ia–sat4–aph(3')-IIIa) (Ergänzende Abbildung S2B). Plasmide ohne ARGs waren in 2 C. jejuni-Isolaten (Größe ca. 4.365 bp) und 2 C. coli-Isolaten (Größe ca. 26.700 bp) vorhanden, die alle aus F4 gewonnen wurden.

Beim Screening auf genetische Determinanten der Resistenz (GDRs) wurden sieben erworbene ARGs und Punktmutationen in zwei weiteren Genen identifiziert, die mit der Resistenz gegen antimikrobielle Mittel assoziiert sind und vier verschiedene Klassen repräsentieren (Abb. 2). Die Kombination der in jedem Isolat nachgewiesenen GDRs führte zu 13 verschiedenen genotypischen Resistenzprofilen (Ergänzungsdatensatz S3). Es gab insgesamt eine sehr gute Übereinstimmung zwischen anfälligen Phäno- und Genotypen; Die einzigen Unterschiede bestanden bei 3 C. coli aus F4 (C0698, C0700 und C0777), die phänotypisch gegen STR resistent waren (MHK = 8 mg/l), aber kein mit STR-Resistenz assoziiertes GDR aufwiesen, und einem C. jejuni aus F1 (C0980), der das tet(O)-Gen in einem Plasmid trug, aber anfällig für TET war (MIC ≤ 0,5 mg/L). Die Resistenz gegenüber β-Lactamen wurde nicht phänotypisch getestet, es wurden jedoch in 47 Isolaten unterschiedliche blaOXA-Gene identifiziert; 5 C. jejuni-Isolate aus F1 trugen das blaOXA-184-Gen und 42 Isolate trugen verschiedene Allele des blaOXA-61-ähnlichen Gens (blaOXA-61 und blaOXA-193 in 17 bzw. 9 C. jejuni und blaOXA-489 in 16 C . coli). In beiden Betrieben war die FQ-Resistenz immer mit einer SNP-Mutation (T86I) im gyrA-Gen in C. jejuni und C. coli verbunden. Die Tetracyclinresistenz bei C. jejuni, die aus F1 gewonnen wurde, war immer mit dem tet(O)-Gen verbunden, im Allgemeinen plasmidkodiert (n = 17), aber auch chromosomal kodiert (n = 3) oder beides (n = 1). In F4 trug TET-resistenter C. jejuni das tet(O/32/O)-Gen im Chromosom (n = 3) oder das tet(O)-Gen in einem Plasmid (n = 1), während in C. coli TET-Resistenz war mit einem chromosomal kodierten tet(O)-Gen (n = 16) verbunden, wobei drei Isolate auch eine zweite Kopie des Gens in einem Plasmid trugen. Bei C. jejuni trat die STR-Resistenz sporadisch auf und war in zwei Isolaten aus F1 mit einer SNP-Mutation in rpsL (K43R) verbunden und in drei Isolaten aus F4 durch das ant(6)-Ia-Gen kodiert. Die Streptomycinresistenz in C. coli wurde immer durch das aadE-Cc-Gen vermittelt (n = 16). Darüber hinaus enthielten 3 C. coli (1 Färse und 2 Kälber) einen Aminoglycosidcluster (tet(O)–Δant(6)-Ia–sat4–aph(3')-IIIa) in einem Plasmid. Somit war die überwiegende Mehrheit der ARGs chromosomal kodiert; Die einzigen plasmidkodierten ARGs waren tet(O), das in allen Plasmiden vorkam (19 C. jejuni und 3 C. coli), und aph(3')-III (die 3 oben genannten C. coli).

Verteilung der genetischen Determinanten der Resistenz (GDR) von C. jejuni- und C. coli-Isolaten in den Betrieben F1 und F4 nach Altersgruppe und Probenahmeort (S01-S12), wie durch WGS ermittelt. Die Zellen sind farblich gekennzeichnet, um das Vorhandensein/Fehlen jedes GDR und seinen genomischen Standort anzuzeigen. GDRs werden nach der Klasse der antimikrobiellen Resistenz, die sie kodieren, sortiert. Phänotypische antimikrobielle Resistenzprofile (AMR) sind entsprechend der Legende farblich gekennzeichnet und antimikrobielle Mittel wurden wie folgt abgekürzt: Erythromycin (ERY), Ciprofloxacin (CIP), Nalidixinsäure (NAL), Streptomycin (STR) und Tetracyclin (TET). Zusätzliche Metadaten wie MLST wurden bereitgestellt (ST, Sequenztyp; CC, klonaler Komplex).

Die MLST-Typisierung ordnete die 56 Isolate 13 Typen zu, darunter zwei neuartige STs, die in C. coli aus F4 identifiziert wurden (ST-12000, n = 15 Isolate; ST-12001, n = 5), die das Ergebnis neuer Kombinationen von Allelen waren und nur Sie unterschieden sich in der Sequenz des tkt-Gens. In F1 gruppierten sich 29 C. jejuni-Isolate in 8 MLST-STs, die zu 6 klonalen Komplexen (CC) gehörten. In F4 wurden die 7 sequenzierten C. jejuni 5 STs (4 CC) und die 20 C. coli den 2 neuen STs (ST12000 und ST12001, beide CC828 zugeordnet) zugeordnet. Nur 2 STs wurden von beiden Betrieben gemeinsam genutzt (ergänzende Abbildung S3), nämlich ST-42 (3 Isolate in F1 ohne GDRs und 1 Isolat in F4 mit dem tet(O)-Gen in einem Plasmid) und ST-45 (1 Isolat in F1 und 2 in F4 mit einem unterschiedlichen ARG-Repertoire in jedem Betrieb).

Als die Genome im vollständigen Datensatz der Virulenzfaktor-Datenbank (VFDB) nach dem Vorhandensein/Fehlen von Genen durchsucht wurden, die für Virulenzfaktoren (VF) kodieren, wurden Treffer für 225 VF (alle chromosomal kodiert) mit unterschiedlichem Identitätsgrad erhalten ( Ergänzungsdatensatz S4). Drei C. jejuni-Isolate aus F1 (C0684, C0690, C0911) hatten ein identisches VF-Profil und waren die einzigen Isolate, die Gene trugen, die für die LOS-Synthese und -Modifikation verantwortlich waren, wie Cj1135, Cj1136, Cj1137c, Cj1138, cstIII, hldE, neuA1, neuB1, neuC1 und wlaN. Das Muster der Anwesenheit/Abwesenheit von VF wurde als vergleichendes genomisches Fingerabdruckinstrument zur Subtypisierung der Isolate verwendet und zeigte eine große genetische Vielfalt unter den sequenzierten Isolaten. Obwohl das VF-Profil gelegentlich in der Lage war, zwischen STs zu unterscheiden, gab es insgesamt eine gute Korrelation zwischen MLST-Typen und VF-Profilen, wobei sich Isolate innerhalb desselben STs basierend auf dem VF-Profil zusammenhäuften.

Die genomische Verwandtschaft zwischen den Stämmen wurde anhand der phylogenetischen Bäume aufgeklärt, die aus den Kerngenom-Alignments abgeleitet wurden (ergänzende Abbildung S4). Obwohl die Charakterisierung des Kerngenoms eine genauere Subtypisierung ermöglichte, wurden C. jejuni-Isolate, die zu demselben ST und CC gehören, im SNP-basierten Baum des Kerngenoms geclustert. In C. coli bildeten ST12000-Isolate jedoch zwei Cluster. Es war bemerkenswert, dass die gleiche Subclusterbildung von ST-12000-C.-coli-Isolaten auch bei der VF-Profilanalyse beobachtet wurde. Einer der Cluster umfasste drei C. coli-Isolate (C0698, C0700 und C0777), die phänotypisch resistent gegen STR (MICSTR = 8 mg/L), aber ohne GDRs waren, sowie ein vollständig anfälliges Isolat (C0850); Der andere Cluster umfasste 11 Isolate mit demselben phänotypischen AMR-Profil und demselben chromosomalen ARG-Gehalt.

Identische Stämme (gleiches MLST-, GDR-, VF- und Kerngenom-SNP-basiertes Clustering) wurden in Tieren unterschiedlicher Altersgruppen in jedem Betrieb isoliert, und in jedem Betrieb überwogen bestimmte genomische Subtypen (Abb. 2 und ergänzender Datensatz S3). In F1 wurde C. jejuni ST-48 während der gesamten Studie in den drei Altersgruppen isoliert; Es war der einzige Typ, der bei Kälbern gefunden wurde, machte 54,5 % (6/11) der Isolate von Färsen aus und wurde nur gelegentlich bei laktierenden Kühen gefunden (2/9, 22,2 %). Alle 17 ST-48-Isolate waren aufgrund einer C257T-SNP-Mutation im gyrA-Gen resistent gegen FQ, alle außer einem (C0906, Kälber, S10) enthielten ein für das tet(O)-Gen kodierendes Plasmid und zwei weitere Isolate ( Färsen, S04 und S08) unterschieden sich dadurch, dass sie aufgrund einer SNP-Mutation im rpsL-Gen STR-resistent waren. Bei Färsen wurden 5 weitere Isolate mit 4 unterschiedlichen Genomprofilen isoliert, die sich in der Anwesenheit und/oder Lage (Plasmid und Chromosome) des tet(O)-Gens unterschieden. Bei laktierenden Kühen war die genomische Vielfalt größer (9 Isolate, 5 Profile). Isolate von ST-267 mit identischen ARG- und VF-Profilen wurden von laktierenden Kühen (S06 und S09) und Färsen (S07) gewonnen.

In F4 wurde C. jejuni nur sporadisch aus laktierenden Kühen und Färsen isoliert, wobei jede Altersgruppe unterschiedliche genomische Subtypen beherbergte. Im Gegensatz dazu war C. coli weiter verbreitet und umfasste zwei MLST-Typen, die beide in allen Altersgruppen nachgewiesen wurden. Allerdings kam der am weitesten verbreitete Typ, ST-12000, bei Kälbern und Färsen vor und wurde während der gesamten Studie nachgewiesen. ST-12001, assoziiert mit einem MDR-Profil (CIP-NAL-STR-TET), wurde erstmals in der zweiten Hälfte der Studie bei laktierenden Kühen nachgewiesen und wurde bei der letzten Probenahme nur bei Kälbern und Färsen nachgewiesen.

Diese Längsschnittstudie zur Überwachung des Auftretens und der Übertragungsdynamik von Antibiotikaresistenzen bei C. jejuni und C. coli bei Milchvieh innerhalb des Betriebs zeigte eine weiter verbreitete Verbreitung von C. jejuni im Vergleich zu C. coli, aber höhere Resistenzraten bei C. coli als in C. jejuni, wie zuvor beschrieben6,12,18. Unter Berücksichtigung der verschiedenen analysierten Altersgruppen war die Resistenz bei Isolaten von Kälbern höher als bei Isolaten von Färsen und laktierenden Kühen. Tatsächlich zeigten alle Isolate von Kälbern eine Resistenz gegen mindestens eine antimikrobielle Klasse, was wahrscheinlich auf altersbedingte Unterschiede in der Managementpraxis und im antimikrobiellen Verbrauch zurückzuführen ist, die mit den typischen Pathologien bei Kälbern (hauptsächlich Atemwegs- und Verdauungsstörungen) verbunden sind. Allerdings variierte auch die Vielfalt der phänotypischen Resistenzprofile zwischen den Betrieben. Um die molekularen Mechanismen der Resistenz zu untersuchen und die Beziehung der zirkulierenden Stämme gründlich zu vergleichen, führten wir daher eine Long-Read-WGS mit ONT an einer Auswahl von 56 Isolaten aus zwei Betrieben durch: F4, das die größte Diversität bei Campylobacter-Arten und AMR-Phänotypen aufwies Profile und F1, wo die Diversität der AMR-Profile geringer war, die Isolationshäufigkeit von C. jejuni jedoch am höchsten war.

Insgesamt 7 erworbene Resistenzgene (aadE-Cc, ant(6)-Ia, aph(3')-III, blaOXA-184, blaOXA-61-like, tet(O) und tet(O/32/O)) und SNP-Mutationen in zwei weiteren Genen (gyrA und rpsL) wurden nachgewiesen. blaOXA war das am weitesten verbreitete Gen, aber β-Lactame wurden nicht in das Mikrodilutionspanel der Brühe einbezogen, da diese Klasse antimikrobieller Mittel nicht zur Behandlung von Campylobacteriose empfohlen wird. Außerdem wurde die G57T-Transversion stromaufwärts der Promotorregion des blaOXA-61-ähnlichen Gens, das die Expression der β-Lactamase19 ermöglicht, hier nicht analysiert. Eine frühere im Baskenland durchgeführte Studie zeigte eine Resistenz gegen Ampicillin bei 38,6 % und 42,9 % der Isolate, die das blaOXA-61-ähnliche Gen trugen, hatten die G57T-Transversion in der Promotorregion16. Bei den übrigen antimikrobiellen Mitteln gab es eine sehr gute Übereinstimmung zwischen der phänotypischen Resistenz und dem Vorhandensein der damit verbundenen ARGs und/oder chromosomalen Punktmutationen, wobei nur 4 Isolate mutmaßliche Diskrepanzen aufwiesen. Dazu gehörten 3 C. coli-Isolate, die aufgrund der beobachteten MHK (MICSTR = 8 mg/L, 1 Verdünnung über dem ECCOF-Wert) höchstwahrscheinlich fälschlicherweise als phänotypisch resistent gegen STR eingestuft wurden. Diese Isolate trugen keine assoziierte GDR und teilten andere genetische Merkmale (z. B. ST, Kerngenom-SNP-basierte Clusterbildung, VF-Profil und Fehlen von GDRs) untereinander und mit einem vollständig anfälligen Isolat, was darauf hindeutet, dass die beobachtete MHK für STR war das Ergebnis der Varianz, die mit dem inhärenten Fehler für MHK-Methoden verbunden ist (± 1 log2 Verdünnung). Andererseits war das C. jejuni-Isolat C0980 anfällig für TET (MHK < 0,5 mg/l), obwohl es das tet(O)-Gen in einem Plasmid trug. Über das Vorhandensein des tet(O)-Gens in phänotypisch anfälligen Campylobacter wurde bereits früher berichtet20,21. Guernier-Cambert et al.21 berichteten über eine P76L-Substitution, um ein nicht funktionsfähiges plasmidbasiertes tet(O)-Gen zu erzeugen. Hier fanden wir nach zweimaliger Sequenzierung des Isolats C0980 und einer eingehenden Sequenzanalyse des tet(O)-Gens (Daten nicht gezeigt) in beiden Fällen eine Deletion in der Nukleotidposition 1078, die zu einer Rasterverschiebung führen und zu einer Funktionsstörung führen würde Gen, was die phänotypische Anfälligkeit für TET erklärt.

In allen 40 phänotypisch resistenten Isolaten wurden voll funktionsfähige TET-Resistenz-kodierende Gene gefunden, wobei das tet(O)-Gen in beiden Arten weit verbreitet war und das Mosaik-Gen tet(O/32/O) auf 3 C. jejuni beschränkt war. Das tet(O)-Gen wurde in C. coli chromosomal kodiert, während es sich in der Mehrzahl der C. jejuni (19/22) in pTet-Plasmiden (Typ 1) befand, die auch mehrere beschriebene Gene des Typ IV-Sekretionssystems (T4SS) enthielten um das Kerngenom der Tet-Plasmide in Campylobacter22 zu bilden. Über die Übertragung plasmidkodierter Antibiotikaresistenz bei Campylobacter wurde häufig berichtet und sie wird als Hauptmechanismus der TET-Resistenz bei C. jejuni angesehen23,24. Das Vorhandensein des tet(O)-Gens in mehr als einer Kopie (eine im Chromosom und eine weitere in einem Plasmid) in 1 C. jejuni und 3 C. coli war möglicherweise das Ergebnis des Erwerbs eines Tet-Plasmids durch ein Isolat, das das Gen bereits im Chromosom trug. Das Mosaik-tet(O/32/O)-Gen ist bei Campylobacter nicht so weit verbreitet wie tet(O), wurde aber interessanterweise im Chromosom von C. jejuni-Isolaten von MLST-Typen gefunden, von denen bereits berichtet wurde, dass sie tet(O/32/O) chromosomal beherbergen ), d. h. ST-6532 und CC206, gewonnen aus Rindern und Schafen16. Das Vorhandensein des tet(O)-Gens entweder auf Plasmiden oder auf dem Chromosom deutet darauf hin, dass Akquisitionsereignisse entweder durch Konjugation oder durch natürliche Transformation erfolgen8,25 als Ergebnis des ständigen Flusses von Resistenzgenen zwischen den in der landwirtschaftlichen Umgebung vorhandenen Bakterien und dem Rinderdarm Mikrobiom.

MLST-Typen, die zu klonalen Komplexen gehören, die als wirtsspezifisch für Rinder gelten (z. B. CC42 und CC22), wurden nachgewiesen, die meisten C. jejuni-Isolate wurden jedoch wirtsgeneralistischen klonalen Komplexen (CC21; CC45; CC48; CC206) zugeordnet, Genotypen, die für den Menschen infektiös sind die häufig von mehreren Wirtsspezies gewonnen werden26,27. Darunter waren die 3 C. jejuni, die in F1 aus laktierenden Kühen und Färsen isoliert wurden und mehrere Gene trugen, die für die LOS-Synthese und -Modifikation verantwortlich sind. Dazu gehörten wlaN, das die Phasenvariation von LOS-Epitopen vermittelt, die für Autoimmunität verantwortlich sind und mit dem Guillain-Barré-Syndrom assoziiert sind28, cstIII (Sialyltransferase), verantwortlich für die Addition von Sialinsäure an LOS Typ C, und die N-Acetylneuraminat-Biosynthese-Gene (neuABC). sowie andere mutmaßliche Außenkern-Zuckertransferasen des LOS wie Cj1135, Cj1136, Cj1137c und Cj1138. Die drei Isolate, die diese Gene beherbergen, wurden in Übereinstimmung mit früheren Beschreibungen von Klasse-C-LOS in Isolaten dieses klonalen Komplexes, die von Menschen und Geflügel stammen, in CC21 eingeteilt29.

Kerngenomanalyse, MLST-Typen (ST und CC) und das Repertoire an GDRs und VFs wurden verwendet, um die Isolate zu charakterisieren und zu vergleichen, die während des 16-monatigen Untersuchungszeitraums aus den beiden Betrieben gewonnen wurden. Die Persistenz bestimmter Genotypen wurde während der gesamten Studie beobachtet, während andere Stämme nur sporadisch nachgewiesen wurden. Während ST-48 in F1 an Kälber angepasst zu sein schien und alle anderen Stämme übertraf, zirkulierte es bei Färsen und laktierenden Kühen gleichzeitig mit mehreren anderen Stämmen, was darauf hindeutet, dass bei älteren Tieren häufiger Kontaminationen aus mehreren Quellen auftraten als bei Kälbern. ST-48-Isolate gruppierten sich basierend auf der Kerngenom-SNP-Analyse und ihrem VF-Profil und trugen ein ähnliches Repertoire an GDRs. Alle bis auf eine enthielten ein nahezu identisches Tet-Plasmid, das auch dem ähnelte, das in einem Isolat eines anderen MLST-Typs (ST-19) gefunden wurde, das am Ende der Studie (S10) von laktierenden Kühen gewonnen wurde. Homologiesuchen mit Blastn zeigten einen hohen Prozentsatz an Identität zwischen diesen und anderen in der GenBank gefundenen Plasmiden, einschließlich derjenigen, die zuvor in C. jejuni von Schafen und Rindern aus derselben Region gefunden wurden16. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich um allgegenwärtige pTet-Campylobacter-Plasmide handelt, von denen bekannt ist, dass sie Resistenzen gegen Tetracyclin übertragen.

In F4 wurde C. jejuni nur sporadisch aus Färsen und laktierenden Kühen isoliert und es gab keine gemeinsamen Genotypen zwischen beiden Altersgruppen. Im Gegensatz dazu war C. coli weit verbreitet, die MLST-Diversität war jedoch geringer; nur 2 STs (ST-12000 und ST-12001), die sich nur im tkt-Allel unterschieden und eng mit anderen weit verbreiteten STs wie ST-1055 bzw. ST-827 verwandt waren (verschiedene glnA-Allele). Über die geringere genetische Diversität von C. coli aus Wiederkäuern im Vergleich zu C. jejuni oder aus Schweinen oder Geflügel isolierten C. coli wurde bereits früher berichtet30,31. Allerdings waren beide Genotypen neu und wurden noch nie beschrieben, was darauf hindeutet, dass die Vielfalt größer ist als berichtet. Alle resistenten C. coli hatten ein ähnliches Repertoire an chromosomal kodierten GDRs, und bei drei ST-12000-C.-coli-Isolaten wurden aufgrund eines 47.150 bp großen Plasmids, das zusätzliche ARGs enthielt (tet(O)–Δant(6)-Ia), große Unterschiede beobachtet –sat4–aph(3')-IIIa). Betrachtet man nur chromosomal kodierte GDRs, bestand der einzige Unterschied zwischen beiden STs im Vorhandensein einer FQ-Resistenz-SNP-Mutation (C257T) im gyrA-Gen aller ST-12001-Isolate, die in ST-12000-Isolaten nicht vorhanden war. In F4 wurde der FQ-resistente Genotyp (ST-12001) in der zweiten Hälfte der Studie zunächst bei laktierenden Kühen (S07, S08, S11) und später (S12) bei Färsen und Kälbern nachgewiesen. Dieses SNP im gyrA-Gen, von dem bekannt ist, dass es am DNA-Supercoiling32 beteiligt ist, sorgt nicht nur für FQ-Resistenz, sondern sorgt auch für eine verbesserte Fitness während der Kommensalkolonisierung8. In diesem Sinne wurde die FQ-Resistenz bei C. jejuni mit einer Zunahme der Virulenz und der Fähigkeit zur Bildung lebensfähiger Biofilme in sauerstoffreichen Umgebungen in Verbindung gebracht9. Dies könnte eine entscheidende Rolle für die Persistenz von FQ-resistenten Isolaten in den Tierreservoiren spielen, selbst wenn kein Antibiotika-Selektionsdruck besteht, und somit den zunehmenden Trend zur FQ-Resistenz bei Campylobacter erklären. Das Auftreten des FQ-R-Genotyps (ST-12001) und der plasmidhaltigen ST-12000-Isolate erfolgte in beiden Fällen gegen Ende der Studie und daher war es nicht möglich, ihre mögliche Ausbreitung und Persistenz im Betrieb zu überwachen . Zusätzliche Probenahmen wären erforderlich gewesen, um zu sehen, ob der FQ-R-Genotyp besser angepasst ist und in der Lage ist, den FQ-S durch lokale klonale Expansion zu übertreffen, und um eine mögliche weitere Verbreitung des C. coli-Plasmids auf andere Isolate zu überwachen.

Zusammenfassend veranschaulichte diese Längsschnittstudie die Diversität und Übertragungsdynamik von resistentem Campylobacter innerhalb des Betriebs im Laufe der Zeit in Milchviehbetrieben und ermöglichte die Erkennung von Veränderungen in den AMR-Profilen und der Entstehung verschiedener Genotypen im Laufe der Zeit. Es wurden sowohl persistente als auch sporadische Stämme entdeckt und Beispiele für Prozesse vorgeschlagen, die zur Entstehung neuer Genomtypen führten, die sich innerhalb der Herden ausbreiten könnten, z. B. der Erwerb extrazellulärer Gene aus anderen Isolaten und intrazelluläre Mutationsereignisse. In jeder Herde waren mehrere Genotypen gleichzeitig vorhanden, aber in einigen Fällen schienen bestimmte Genotypen besser angepasst zu sein und blieben bis zu 16 Monate bestehen (z. B. ST-48 in F1 und ST-12000 in F4). Die auf der Sequenzierung des gesamten Genoms basierende Langzeitüberwachung trug dazu bei, die komplexe Epidemiologie zu entschlüsseln, die der Verbreitung resistenter Campylobacter innerhalb des Betriebs zugrunde liegt.

In die Studie wurden fünf kommerzielle landwirtschaftliche Betriebe (bezeichnet als F1, F2, F3, F4 und F5) im Baskenland (Nordspanien) einbezogen, die repräsentativ für den Landwirtschaftsstil in der Region sind. Bei allen Betrieben handelte es sich um geschlossene Produktionssysteme, bei denen Ersatzfärsen aus demselben Betrieb stammten. Zwei der Betriebe (F2 und F4) züchteten ihre Ersatzfärsen außerhalb des Geländes in zwei verschiedenen Zuchtzentren. Die landwirtschaftlichen Betriebe befanden sich in den drei Landkreisen des Baskenlandes, und die Entfernung zwischen den landwirtschaftlichen Betrieben lag zwischen 15 und 25 km für Betriebe innerhalb desselben Landkreises (d. h. F3–F4 bzw. F1–F2) und bis zu 160 km (F4). –F5). Weitere Einzelheiten zu allgemeinen Informationen über landwirtschaftliche Merkmale, Managementpraktiken, Impfprogramme und den Einsatz antimikrobieller Arzneimittel wurden an anderer Stelle berichtet33.

Die Probenahmestrategie, die als einjährige Studie mit monatlichen Probenahmen geplant war, wurde durch die COVID-19-Pandemie unterbrochen und von Februar 2019 bis Oktober 2020 verlängert. Rektale Fäkalien wurden von Kälbern (1–5 Monate alt) und Färsen (jung) gesammelt Kühe, die noch kein Kalb zur Welt gebracht haben, ca. 6–22 Monate alt) und laktierende Kühe (Tiere in der Melkzeit zum Zeitpunkt der Probenahme) während 12 Probenahmen über einen Zeitraum von 16 Monaten; einer der Betriebe (F5) schied nach 5 Probenahmen aufgrund betrieblicher Veränderungen aus. Zu jedem Probenahmezeitpunkt und in jedem Betrieb wurden fünf Tiere innerhalb jeder Altersgruppe nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und rektaler Kot (mindestens 5 g) mit einer behandschuhten Hand gesammelt und der Kot der 5 Tiere derselben Altersgruppe in einem einzigen 25 g analysiert Schwimmbad. In den Betrieben F2 und F4 befanden sich Färsen zu mehreren Probenahmeterminen im Zuchtzentrum (5 Probenahmen in F2 und 2 in F4) und der Kot konnte nicht gesammelt werden. Somit wurden insgesamt 760 rektale Stuhlproben gesammelt und in 152 Pools analysiert.

Die Probenentnahme wurde von Tierärzten unter strikter Einhaltung der spanischen Ethikrichtlinien und Tierschutzbestimmungen (Real Decreto 53/2013) durchgeführt. Die Sammlung dieses Materials galt als routinemäßige tierärztliche Praxis und erforderte keine Genehmigung der Ethikkommission für Tierversuche. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme wurde von den Farmbesitzern eine mündliche Einverständniserklärung eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und entsprachen den ARRIVE-Richtlinien34.

Zur Isolierung thermophiler Campylobacter spp. wurden 25 g gepoolte rektale Stuhlproben 1:10 in Preston-Brühe verdünnt, homogenisiert und zur Anreicherung 18 ± 2 Stunden bei 42 °C inkubiert. Suspensionen (0,1 ml) wurden dann auf einem Chromogen-Campylobacter-Selektivagar (CASA® Agar, Biomerieux) subkultiviert und bei 42 °C in einer mikroaeroben Atmosphäre (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2) 48–72 Stunden lang inkubiert. Um den mutmaßlichen Campylobacter zu bestätigen und die vorhandenen Arten zu identifizieren, wurden 10 einzelne Kolonien mithilfe einer Multiplex-Echtzeit-PCR getestet, die auf das C. jejuni-mapA-Gen und das C. coli-ceuE-Gen abzielte35. Wenn weder C. jejuni noch C. coli durch Koloniepickung identifiziert werden konnten, wurde DNA aus einer Öse voller Bakterienkultur in CASA®-Agar (InstaGene, BioRad, CA, USA) extrahiert und auf das Vorhandensein von Campylobacter spp. untersucht. durch eine Echtzeit-PCR, die das 16S-rRNA-Gen der Gattung Campylobacter36 amplifiziert. Zur weiteren Charakterisierung wurden maximal 2 C. jejuni- und 2 C. coli-Kolonien pro Probe aufbewahrt.

Sofern verfügbar, wurden 2 Isolate pro Platte und Campylobacter-Spezies (d. h. C. jejuni und C. coli) ausgewählt und getestet, um die antimikrobielle Empfindlichkeit zu beurteilen. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) wurden durch Mikroverdünnung der Brühe unter Verwendung von Sensititre® EUCAMP2 Susceptibility Plates (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) bestimmt, die zweifache Reihenverdünnungen von sechs antimikrobiellen Wirkstoffen enthielten: Gentamicin (GEN), Streptomycin (STR), Tetracyclin ( TET), Ciprofloxacin (CIP), Nalidixinsäure (NAL) und Erythromycin (ERY). Antimikrobielle Mittel und serielle Verdünnungsbereiche wurden gemäß den Empfehlungen des Durchführungsbeschlusses 2013/652/EU der Kommission ausgewählt. Die MHK-Ergebnisse wurden unter Verwendung epidemiologischer Grenzwerte (ECOFF) interpretiert, die vom Europäischen Komitee für antimikrobielle Suszeptibilitätstests (EUCAST, http://www.eucast.org) entwickelt wurden, um die mikrobiologische Resistenz gegen das betreffende antimikrobielle Mittel zu definieren Unterscheidung zwischen Mikroorganismen mit und ohne erworbene Resistenzmechanismen (Mutante bzw. Wildtyp).

Sechsundfünfzig Isolate aus F1 (29 C. jejuni) und F4 (7 C. jejuni und 20 C. coli) wurden auf der Grundlage ihres Probenahmezeitpunkts und ihrer Altersgruppenquelle ausgewählt und einer WGS mit langen Lesevorgängen (Oxford Nanopore Technologies, ONT) unterzogen . Genomische DNA wurde aus Reinkulturen mit dem NZY Microbial gDNA Isolation Kit (NZYtech) extrahiert und eine Bibliothek wurde mit dem ONT Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) erstellt. Genomische DNA-Kits mit nativem Barcode (EXP-NBD104 und EXP-NBD114) wurden für das Probenmultiplexen verwendet und Bibliotheken wurden in FLO-MIN106 (R9.4.1) oder FLO-MIN111 (R10.3) Durchflusszellen auf einem MinION Mk1C-Gerät (ONT) ausgeführt ). Die durch die ONT-Sequenzierung generierten Ausgabedateien wurden im Hochgenauigkeitsmodus (HAC) als Basis aufgerufen und mit Guppy v.5.0 (Qscore > 8) qualitätsgefiltert. Lesevorgänge wurden mit Porechop v.0.2.4 mit den Standardparametern37 (Wick 2017) adaptiv getrimmt und mit Filtlong v.0.2.0 (https://github.com/rrwick/Filtlong) nach Länge und Qualität gefiltert, indem kurze Lesevorgänge verworfen wurden (< 1000 bp) und die besten 90 % der verbleibenden Lesevorgänge für weitere Analysen behalten (–min_length 1000 –keep_percent 90). Anschließend wurden die resultierenden Fastq-Lesevorgänge mit Unicycler38 de novo zusammengestellt. MLST-Profile wurden aus nicht zusammengesetzten Long-Reads mit Krocus39 ermittelt. Neue Kombinationen vorhandener Allele wurden zusammen mit repräsentativen Isolatdaten zur neuen ST-Definition an die Campylobacter-MLST-Datenbank pubMLST übermittelt40. Genome wurden verarbeitet, um von Plasmiden und Chromosomen abgeleitete Contigs mit PlasFlow (v.1.1) vorherzusagen (Krawczyk et al.41), und kleine kreisförmige Contigs wurden anhand der Blastn-Datenbank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) abgefragt /Blast.cgi) mit Standardparametern und dem niedrigsten E-Wert wurde als bester Treffer angesehen. BLASTn v.2.12.0+42 und ABRicate v.1.0.1 (T. Seemann, https://github.com/tseemann/abricate) wurden verwendet, um die Entwurfsgenome gegen ResFinder43 zum Nachweis erworbener antimikrobieller Resistenzgene zu screenen gegen VFDB_setB (vollständiger Datensatz) für Virulenzfaktoren. Mit AMR assoziierte chromosomale Punktmutationen wurden durch Screening nicht zusammengesetzter Lesevorgänge anhand der PointFinder-Datenbank44 mithilfe von Resfinder v.4.1.045 untersucht. Die verwendeten Datenbanken wurden alle am 05.11.2022 aktualisiert.Resfinder-Treffer wurden mit einer Abdeckung und Identität von 90 % gefiltert. Virulenzgene wurden mit einer Abdeckung von 90 % und einer Identität von 60 % gefiltert, und das Muster der Anwesenheit/Abwesenheit dieser Gene wurde als Typisierungsschema für vergleichende genomische Fingerabdrücke verwendet, unterstützt durch ein Dendrogramm. Die hierarchische Clusteranalyse für das Dendrogramm wurde mit der ungewichteten Paargruppenmethode mit arithmetischem Mittelwert (UPGMA) basierend auf der Jaccard-Distanzmatrix unter Verwendung der Funktion hclust (v.3.6.1) des R-Statistikpakets v.3.6.3 durchgeführt . Plasmid-Alignments wurden mit MAUVE im progressiven Modus46 in der Software Geneious Prime v. 2020.2.4 (https://www.geneious.com) durchgeführt und GDR-Anordnungen wurden mit SnapGene v.5.2.4 (http://www.snapgene) grafisch dargestellt .com/). Parsnp v1.7.447 wurde zusammen mit dem implementierten RaxML v.8.2.1248 verwendet, um Kerngenomanalysen durchzuführen und phylogenetische Bäume auf der Grundlage der chromosomalen Genome zu erstellen, um Struktur- und Punktvariationen (SNPs) zu identifizieren, mit Standardparametern und der Angabe von -r! Parameter zur zufälligen Auswahl der Referenz aus der Menge der analysierten Genomen. Die resultierenden Bäume wurden mit iTOL49 visualisiert.

Unterschiede in der AMR-Prävalenz zwischen den verschiedenen Campylobacter-Arten, Altersgruppen und/oder Betrieben wurden mit multivariaten logistischen Regressionen bewertet. Angepasste Odds Ratios (ORadj) wurden als Maß für den Zusammenhang zwischen Positivität und den erklärenden Variablen verwendet und mit einem Konfidenzintervall von 95 % (95 %-KI) ausgedrückt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p < 0,05. Die Analysen wurden mit der Statistiksoftware Stata/IC Version 16.1 (StataCorp LP, College Station, TX, USA) durchgeführt.

Rohe Sequenzierungsdaten der 56 in dieser Studie analysierten Stämme sind in der NCBI Sequence Read Archive (SRA)-Datenbank unter den Zugangsnummern verfügbar, wie im Ergänzungsdatensatz S5 aufgeführt, der dem BioProject PRJNA 932719 zugeordnet ist.

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Wir danken den Tierärzten, die die Probennahmen durchgeführt haben, und den Landwirten für ihre Mitarbeit bei dieser Studie. Die Autoren danken Dr. Gorka Aduriz (NEIKER) für seine technischen Ratschläge und hilfreichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für wirtschaftliche Entwicklung, Nachhaltigkeit und Umwelt der baskischen Regierung unterstützt (Projekt URAGAN 21-00012).

Abteilung für Tiergesundheit, NEIKER – Baskisches Institut für landwirtschaftliche Forschung und Entwicklung, Baskische Forschungs- und Technologieallianz (BRTA), Bizkaia Science and Technology Park 812L, 48160, Derio, Bizkaia, Spanien

Medelin Ocejo, Beatriz Oporto und Ana Hurtado

Abteilung für Angewandte Mathematik, NEIKER – Basque Institute for Agricultural Research and Development, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), Bizkaia Science and Technology Park 812L, 48160, Derio, Bizkaia, Spanien

Jose Luis Lavin

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AH konzipierte und koordinierte die Studie. BO führte Laboranalysen durch. JLL und MO führten bioinformatische Datenanalysen durch. MO führte statistische Analysen durch. AH und MO interpretierten die Daten und verfassten das Manuskript. BO und JLL trugen zur Überarbeitung des Manuskripts bei. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ana Hurtado.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ocejo, M., Oporto, B., Lavín, JL et al. Überwachung der Übertragungsdynamik von antimikrobiell resistentem Campylobacter bei Milchkühen innerhalb des Betriebs mittels Mikroverdünnung der Brühe und Langzeitsequenzierung des gesamten Genoms. Sci Rep 13, 12529 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39588-3

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Eingegangen: 12. April 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39588-3

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