Für den entwicklungsgesteuerten Zelltod bei Streptomyces coelicolor ist ein kontraktiles Injektionssystem erforderlich

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1469 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Verschiedene Bakterienarten produzieren extrazelluläre kontraktile Injektionssysteme (eCIS). Obwohl eCIS eng mit kontraktilen Phagenschwänzen verwandt sind, können sie toxische Proteine in eukaryontische Zellen injizieren. Daher werden diese Systeme allgemein als zytotoxische Abwehrmechanismen angesehen, die für andere Aspekte der Bakterienbiologie keine zentrale Rolle spielen. Hier liefern wir Beweise dafür, dass eCISs offenbar am komplexen Entwicklungsprozess des Bakteriums Streptomyces coelicolor beteiligt sind. Insbesondere zeigen wir, dass S. coelicolor während seines normalen Wachstumszyklus eCIS-Partikel produziert und dass Stämme, denen funktionelle eCIS-Partikel fehlen, deutliche Veränderungen in ihrem Entwicklungsprogramm aufweisen. Darüber hinaus weisen eCIS-defiziente Mutanten während des Wachstums in flüssigen Medien einen verringerten Zelltod und eine veränderte Morphologie auf. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Hauptaufgabe von eCISs in S. coelicolor darin besteht, den Entwicklungswechsel zu modulieren, der zur Bildung und Sporulation von Lufthyphen führt, und nicht darin, andere Arten anzugreifen.

Viele Bakterienstämme kodieren für extrazelluläre kontraktile Injektionssysteme (eCIS)1,2,3. eCIS sind eng mit den Schwänzen von Bakteriophagen (Phagen) mit kontraktilem Schwanz verwandt. Sie bestehen wie Schwänze aus einem langen Rohr, das an einer Grundplatte befestigt ist (Abb. 1a). Die Proteine, aus denen die eCIS-Schwanzstruktur besteht, ähneln in ihrer Sequenz den Phagenproteinen. Genomregionen, die für eCIS kodieren, unterscheiden sich jedoch von Phagenschwanzregionen dadurch, dass sie ausnahmslos eine AAA + ATPase mit unbekannter Funktion und ein Schwanzterminatorprotein (TR) kodieren, das Mitglied der Pfam-Familie Pvc16_N (PF14065) ist4,5. Sie kodieren auch oft für erkennbare Toxinproteine2,6,7. Alle eCIS mit charakterisierten Funktionen vermitteln Interaktionen zwischen bakteriellen und eukaryotischen Zellen. Serratia- und Photorhabdus-Arten setzen eCIS-Strukturen frei, die als Anti-Feeding-Prophagen (Afp) bzw. Photorhabdus-Virulenzkassetten (PVC) bekannt sind und die Abtötung von Insektenzellen vermitteln8,9. Diese Abtötung erfolgt durch die Injektion von insektiziden Toxinen, die stromabwärts des eCIS-Operons kodiert sind8,9,10. MACs (Metamorphosis Associated Contractile Structures) sind eigenständige eCIS, die vom Meeresbakterium Pseudoalteromonas luteoviolacea produziert werden und für die Morphogenese des Röhrenwurms Hydroides elegans in einer wechselseitigen Interaktion erforderlich sind11. Die Strukturen mehrerer anderer eCIS wurden im Detail untersucht12,13,14, ihre Funktionen wurden jedoch nicht bestimmt.

a Schematische Darstellung eines eCIS-Partikels. Das Diagramm zeigt die konservierten Kernstrukturkomponenten eines eCIS-Schwanzes. Proteine werden durch Abkürzungen angegeben (TR = Schwanzterminator; TT = Schwanzrohr; TS = Schwanzscheide; BH1, BH2 = Basisplattennabenkomponenten; BW1, BW2, BW3 = Basisplattenkeilkomponenten; BS = Schwanzspitze). b, Schematische Darstellung des eCIS-Clusters von Streptomyces coelicolor (Sco). Offene Leserahmen und ihre Transkriptionsrichtung werden durch Blockpfeile dargestellt und sind maßstabsgetreu dargestellt. Der Genname wird unter dem ersten und letzten Gen im Cluster angezeigt und reicht von sco4242 bis sco4263. Die verschlüsselte eCIS-Funktion wird als Abkürzung über jedem ORF angezeigt. Die Afp eCIS-Annotation, die in einigen anderen Veröffentlichungen verwendet wird, wird innerhalb der Pfeile angezeigt (Afp1-1619). Die beiden divergierenden Promotorregionen werden als rote Blöcke dargestellt. Die Vorwärts- und Rückwärtstranskriptionsrichtungen werden in blauen Pfeilen über dem Cluster angezeigt. c, eCIS wurden aus Sco-Lysaten gereinigt, die 72 Stunden lang in flüssigem YEME-Medium gezüchtet wurden, wie in „Methoden“ beschrieben. Gereinigte Präparate wurden auf das 30-fache der Konzentration der ursprünglichen Kultur konzentriert. Transmissionselektronenbilder wurden mit 100.000-facher Vergrößerung aufgenommen. Weiße Pfeilspitzen weisen auf leere Hüllen hin, die zusammen mit vollständig montiertem eCIS vorhanden sind. d Ein einzelnes zusammengesetztes eCIS-Partikel in seiner nicht kontrahierten erweiterten Konformation ist dargestellt. Der weiße Pfeil zeigt auf die Grundplatte und der schwarze Pfeil zeigt den Schwanzterminatorkomplex. e Partikel aus den zellfreien Medien von Kulturen, die wie in Tafel (c) beschrieben gezüchtet wurden, wurden ultrazentrifugiert und auf das 30-fache der Konzentration der Originalprobe konzentriert. Mit 80.000-facher Vergrößerung aufgenommene Bilder. Weiße Pfeile deuten auf typische entleerte, kontrahierte Schwanzscheidenpartikel hin. Maßstabsbalken = 100 nm. f Streudiagramm der Länge und Breite der in (c–e) beschriebenen eCIS-abgeleiteten Partikel (n = 80 für vollständig zusammengesetzte, nicht kontrahierte intrazelluläre Partikel, n = 215 für extrazellulär kontrahierte Partikel mit leerer Hülle). Innerhalb jedes Diagramms kennzeichnen horizontale Linien die Mittelwerte, die auch über dem Diagramm angezeigt werden. Die vertikalen Ränder kennzeichnen den gesamten Bereich der Werteverteilung.

eCIS-Regionen wurden eindeutig durch horizontalen Gentransfer verbreitet, was zu ihrem sporadischen Auftreten in verschiedenen Bakteriengruppen geführt hat2,3. Eine auffällige Ausnahme von diesem Muster ist bei der Gattung Streptomyces zu beobachten, wo die Mehrheit der Arten (>70 %) mindestens ein eCIS kodieren. Streptomyces vermehren sich durch ein komplexes Entwicklungsprogramm. Gekeimte Sporen wachsen zunächst zu ausgedehnten vegetativen Hyphen durch eine Kombination aus Spitzenverlängerung und Verzweigung15. Bei Nährstoffmangel oder Stress führen programmierte Entwicklungs- und morphologische Veränderungen zur Bildung von Lufthyphen und anschließender Sporenbildung. Dieser Entwicklungswechsel geht mit einer starken Verschiebung der Genexpression und dem Beginn der Produktion von Sekundärmetaboliten einher, von denen es sich bei vielen um Antibiotika handelt16,17.

Angesichts des einzigartig komplexen Lebensstils von Streptomyces und der Verbreitung von eCIS-kodierenden Regionen in dieser Gattung stellten wir die Hypothese auf, dass eCIS eine grundlegende Rolle im Entwicklungsprogramm dieser Bakterien spielen könnte. Um diese Idee zu testen, haben wir Studien zur eCIS-kodierenden Region des Modellstamms Streptomyces coelicolor A3(2) (Sco) initiiert, der über eine einzige eCIS-kodierende Region verfügt. Das Ziel dieser Experimente bestand darin, festzustellen, ob eCIS als Teil des normalen Sco-Lebenszyklus erstellt werden und welche Rolle diese wenig charakterisierten Einheiten möglicherweise spielen.

eCIS-Partikel bestehen aus einem konservierten Satz von Strukturproteinen, die homolog zu Proteinen sind, die in Phagen mit kontraktilem Schwanz vorkommen (Abb. 1a)18. Der röhrenförmige Abschnitt besteht aus einem Endrohr (TT), das mit einer Hülle (TS) ummantelt ist, die die Kontraktion vermittelt. Das Röhrchen ist an einem Ende an einer Grundplatte befestigt, die durch Anbringen von sechs Keilen (bestehend aus den Proteinen BW1, BW2 und BW3) an einer Nabe mit den Proteinen BH1 und BH2 hergestellt wird. Das andere Ende des Röhrchens ist mit dem Terminatorprotein (TR) verschlossen. Die Zelloberflächenhaftung wird normalerweise durch Fasern vermittelt, die an der Grundplatte befestigt sind. Gene, die alle konservierten eCIS-Strukturproteine und eine AAA + ATPase kodieren, die auch in eCIS-kodierenden Regionen konserviert ist, finden sich in einer Region des Sco-Genoms (Abb. 1b).

Um zu bestimmen, ob Wildtyp (WT) Sco eCIS-Partikel produziert, wurden Zelllysate von Sco-Kulturen, die 72 Stunden lang in flüssigem Medium gezüchtet wurden, einem Standard-eCIS-Reinigungsprotokoll unterzogen (siehe Methoden). Die Untersuchung der resultierenden gereinigten Proben mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ergab zahlreiche phagenschwanzartige Partikel mit einer durchschnittlichen Länge von 295 nm und einer Breite von 21 nm (Abb. 1c, d, f). Diese Partikel ähneln stark zuvor beobachteten eCIS-Partikeln mit einer abgerundeten Kappe an einem Ende und einer Grundplatte am anderen Ende, wie durch Pfeile angezeigt (Abb. 1d)5,19,20. Die Grundplatte ist etwas kleiner als bei anderen eCIS und Fasern, die an den Grundplatten einiger eCIS5,11,21 angebracht sind, waren nicht erkennbar. Die gereinigten Proben enthielten auch viele leere Hüllenstrukturen unterschiedlicher Länge (Abb. 1c, weiße Pfeilspitzen).

Bemerkenswerterweise zeigten TEM-Aufnahmen der extrazellulären Fraktion (Überstand, der nach der Zellpelletierung gesammelt wurde) nur scheinbar entleerte Hüllen, die nach der eCIS-Kontraktion zurückgeblieben waren (Abb. 1e). Diese Strukturen waren 100–150 nm lang und 28–35 nm breit und hatten ein typisches Streifenmuster, das für polymerisierte Schwanzscheiden charakteristisch ist. Sie hatten jedoch keine Dichte in der Mitte und waren breiter als reife Wildtyp-eCIS-Schwänze (Abb. 1f). Das Schwanzscheidenprotein (TS) wurde auch in der extrazellulären Fraktion (E) durch Western Blot nachgewiesen (ergänzende Abbildungen 1a, b, d). Das rein zytoplasmatische Protein ActR wurde in der extrazellulären Fraktion nicht nachgewiesen (ergänzende Abbildung 1b, d), was darauf hindeutet, dass das Auftreten von TS-Protein in dieser Fraktion nicht auf eine weit verbreitete Zelllyse zurückzuführen ist. Sco-Stämme mit Deletionen in den Genen, die entweder für die Schwanzscheide (ΔTS) oder die Grundplattenkeilproteine (ΔBP) kodieren, zeigten in extrazellulären Proben oder Zelllysaten keine schwanzähnlichen Strukturen. Western Blots bestätigten das Fehlen dieser Proteine in den Mutantenstammpräparaten (ergänzende Abbildungen 1a, c, d).

Um die Rolle der ATPase bei der Bildung von eCIS-Partikeln zu untersuchen, erzeugten wir eine Deletion im Sco AAA + ATPase-Gen (sco4259) und führten wie oben beschrieben TEM-Experimente an Lysaten dieser Mutante durch. Die produzierten eCIS-Partikel schienen mit denen des WT-Stammes identisch zu sein (ergänzende Abbildung 2a). Ähnliche Mengen an extrazellulären leeren Hüllen wurden ebenfalls beobachtet (ergänzende Abbildung 2b, c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ATPase für die Produktion von eCIS-ähnlichen Partikeln mit normalem Aussehen und normaler Kontraktionsfähigkeit nicht erforderlich ist. Dieser Befund stimmt mit der Arbeit am Photorhabdus eCIS5 überein, die auch zeigte, dass normal aussehende eCIS-Partikel in Abwesenheit der ATPase5 gebildet werden.

Wir verwendeten Massenspektrometrie, um die Zusammensetzung der von Sco hergestellten gereinigten schwanzähnlichen Partikel zu bestimmen. Wie erwartet wurden die meisten eCIS-Strukturproteine (Abb. 1a), die Phagenschwanzhomologe aufweisen, in allen drei Reinigungen (TR, TS, TT, BH2, BW2) nachgewiesen, während andere dieser konservierten Strukturproteine (BH1 und BW1) nachgewiesen wurden in mindestens einer von drei separaten Reinigungen durchgeführt (Ergänzungstabellen 1 und 2). BW3 war das einzige konservierte Strukturprotein, das bei keiner Reinigung nachgewiesen wurde. Zwei Proteine mit unbekannter Funktion, kodiert durch die Gene sco4242 und sco4256, wurden in allen drei Reinigungen nachgewiesen, und ein weiteres, kodiert durch sco4251, wurde in mindestens einer Reinigung nachgewiesen. Die AAA + ATPase wurde in gereinigten eCIS-Partikeln nicht nachgewiesen. Wir haben auch Massenspektrometrie an eCIS-bezogenen Partikeln durchgeführt, die aus der extrazellulären Fraktion gereinigt wurden. In diesem Fall haben wir nur TS- und TT-Proteine nachgewiesen, die wahrscheinlich Bestandteile der leeren, kontrahierten Hüllen sind, die durch TEM beobachtet wurden. Wichtig ist, dass gereinigte Präparate, die aus der ∆BP-Mutante hergestellt wurden, nur TT- und TS-Proteine enthielten, was zeigt, dass der Nachweis der meisten eCIS-Proteine den richtigen eCIS-Zusammenbau erfordert, der ohne die Grundplatten-Keilproteine nicht stattfinden kann5. Aggregate aus TS- und TT-Protein können weiterhin durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation gereinigt werden. Insgesamt zeigen diese Massenspektrometrieexperimente, dass die von uns gereinigten schwanzförmigen Partikel tatsächlich aus der eCIS-Region von Sco stammen und dass die Zusammensetzung dieser Partikel mit der anderer eCIS identisch ist.

In einer früheren Studie wurde darauf hingewiesen, dass das eCIS von Streptomyces lividans für eine wachstumshemmende Wirkung gegen die Hefe Saccharomyces cerevisiae verantwortlich ist22. Da die Komponenten von S. lividans eCIS in ihrer Reihenfolge denen des Sco-Systems sehr ähnlich sind, war es von Interesse zu bestimmen, ob auch das Sco eCIS diese Aktivität zeigte. Wie in Abb. 2a gezeigt, stellten wir fest, dass WT Sco tatsächlich das Wachstum von S. cerevisiae hemmte und dass diese Aktivität beim ∆TS-Stamm nicht beobachtet wurde. Da bekannt ist, dass Sco mehrere Antibiotika produziert, die zur beobachteten Wachstumshemmung beitragen könnten, haben wir die Fähigkeit des Sco-Stamms M115223 getestet, in dem Genomregionen gelöscht sind, die für die Synthese der vier wichtigsten Sco-Antibiotika erforderlich sind (Δact, Δred, Δcda, Δcpk). , um das Hefewachstum zu hemmen. Wir haben bestätigt, dass dieser Stamm immer noch eCIS-bezogene Partikel produziert (ergänzende Abbildung 3a). Wir fanden heraus, dass weder der Stamm M1152 noch eine mutierte Version dieses Stamms, die kein eCIS produziert (M1152∆TS), das Hefewachstum hemmten (Abb. 2a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Antibiotika für die Wachstumshemmung von S. cerevisiae erforderlich sind und dass das Fehlen von eCIS indirekt die Hemmaktivität beeinflussen kann, indem es die Antibiotikaproduktion stört.

Die Tests wurden durchgeführt, indem auf Agarplatten 105 SFU von Sco-Wildtyp (WT), Tail-Sheath-Knockout (ΔTS), M1152 (eine Mutante, die nicht die vier wichtigsten Sco-Antibiotika produziert) oder M1152 mit einer Tail-Sheath-Knockout-Mutation ( M1152 ΔTS). Die Zellen wurden 3 Tage lang gezüchtet, bevor sie mit den zu testenden Arten überschichtet wurden, wie in jeder Tafel angegeben. a Lichtungszonen um die Sco-Kolonien weisen auf Letalität oder wachstumshemmende Aktivität gegenüber dem Indikatorrasen hin. Alle für einen getesteten Stamm gezeigten Ergebnisse wurden von derselben Agarplatte erhalten. b Die Hemmwirkung der Sco M145-Stämme wurde durch Berechnung der Oberfläche der Clearance-Zone um jede Kolonie herum quantifiziert. Die Ergebnisse werden als Boxplots angezeigt. Die mittlere horizontale Linie bezeichnet den Median und die Kästchen erstrecken sich vom 25. bis zum 75. Perzentil der Werte, Whiskers zeigen den gesamten Bereich der Werteverteilung pro Stamm. n = 6 biologisch unabhängige Experimente in Tests gegen M. luteus, n = 8 in Tests gegen S. cerevisiae (105) und n = 6 in Tests gegen S. cerevisiae (106). M1152-Stämme zeigten keine Hemmwirkung gegen M. luteus oder S. cerevisiae. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Ähnlich wie bei unseren Ergebnissen mit S. cerevisiae stellten wir fest, dass Sco das Wachstum der grampositiven Bakterienart Micrococcus luteus hemmte und dass diese Hemmung im ∆TS-Stamm teilweise abgeschwächt wurde (Abb. 2a, b). Dem Stamm M1152 und der ∆TS-Mutante fehlte diese Aktivität jedoch. Schließlich stellten wir fest, dass Sco das Wachstum von vier verschiedenen Streptomyces-Arten hemmte, der ∆TS-Stamm jedoch das gleiche Ausmaß an Hemmung aufwies, was bedeutet, dass das eCIS für die Wachstumshemmung nicht erforderlich war (ergänzende Abbildung 3b). Zusammenfassend zeigen diese Experimente zur Wachstumshemmung, dass Sco das Wachstum einiger Bakterienarten und von S. cerevisiae hemmt, es scheint jedoch keine direkte Rolle für eCIS bei dieser Aktivität zu geben.

Angesichts des offensichtlichen Mangels an Tötung anderer Arten durch das Sco eCIS postulierten wir, dass eCIS während des normalen Entwicklungsprogramms eine Zelltötungsaktivität innerhalb des Stammes vermitteln könnte. Um das Ausmaß des Zelltods während der Sco-Differenzierung sichtbar zu machen und zu quantifizieren, verwendeten wir einen bewährten Test auf die Lebensfähigkeit von Bakterien24. Die Proben werden mit SYTO 9 gefärbt, das sowohl lebende als auch tote Zellen markiert, und mit Propidiumiodid (PI), das nur Bakterien mit beschädigten Membranen, die wahrscheinlich tot sind, durchdringt und färbt. Wenn beide Flecken vorhanden sind, erscheinen lebende Bakterien grün, während tote Bakterien rot erscheinen. Nach 48-stündigem Wachstum in flüssigen Medien ließ WT Sco Myzelpellets wachsen, wie bereits zuvor beobachtet wurde25,26. Der durchschnittliche Durchmesser dieser Pellets betrug 85 µm (Abb. 3a). Pellets gleicher Größe wurden bei den eCIS-defizienten Stämmen beobachtet. Durch Quantifizierung der Färbung durch SYTO9 und PI berechneten wir das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen in den WT-Kulturen auf 0,8 (Abb. 3a). Das Lebend-Tot-Verhältnis war in den Mutantenkulturen etwas geringer, obwohl der Unterschied nicht signifikant war. Unterschiede zwischen dem WT und den eCIS-defizienten Stämmen wurden an den Wachstumspunkten nach 54 und 74 Stunden deutlich. WT-Proben entwickelten viele große Myzelpellets mit einem Durchmesser von 100 bis 300 µm, die in der Mitte eine erhöhte PI-Färbung aufwiesen (Abb. 3b, c). Im Gegensatz dazu blieb in beiden eCIS-defizienten Mutanten das Übergewicht der beobachteten Hyphenpellets gering, wobei die durchschnittliche Pelletgröße halb so groß war wie die von WT Sco. Darüber hinaus war das Verhältnis lebender/toter Zellen der Mutanten doppelt so hoch wie das des WT (Abb. 3b, c). Insgesamt zeigen diese Daten, dass die Entwicklung von WT Sco in flüssigen Medien mit der Bildung großer Myzelpellets und einem erheblichen Zelltod einhergeht. Mutanten, denen eCIS-Partikel fehlen, weichen erheblich von diesem Verhalten ab und zeigen kleinere Zellpellets und eine viel geringere Häufigkeit von Zelltod.

Sco-Wildtyp-Stämme (WT), Tail-Sheath-Knockout-Stämme (ΔTS) oder Baseplate-Knockout-Stämme (ΔBP) wurden in 50 ml YEME-Medium mit einer Endkonzentration von 107 SFU/ml inokuliert. A, 48 Stunden, b, 54 Stunden oder c, 74 Stunden nach der Inokulation wurden die Proben mit gleichen Anteilen von SYTO 9, einem membrandurchdringenden Nukleinsäurefarbstoff, und Propidiumiodid, das nur tote oder beschädigte Zellen färbt, gefärbt. Daher werden tote und lebende Zellen durch rote bzw. grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht. Das Verhältnis lebender/toter Zellen wurde aus den Gesamtwerten der Fluoreszenzintensität pro Bild berechnet. Die Durchmesser einzelner Myzelpellets wurden manuell gemessen (für WT, ΔTS bzw. ΔBP; nach 48 Stunden – n = 99, 116, 131, nach 54 Stunden – n = 173, 113, 138 und nach 74 Stunden – n = 73). 69, 71). Die Ergebnisse werden als Boxplots angezeigt. Die mittlere horizontale Linie stellt den Median dar und die Kästchen erstrecken sich vom 25. bis zum 75. Perzentil der Werte. Whiskers bezeichnen Werte innerhalb des 5.–95. Perzentilbereichs, wobei einzelne Datenpunkte für die Werte außerhalb dieses Bereichs angezeigt werden. Zur Berechnung der statistischen Signifikanz wurden eine einfaktorielle ANOVA und der Mehrfachvergleichstest von Dunnett durchgeführt. Die angepassten P-Werte werden über den entsprechenden Diagrammen angezeigt. In (b) beträgt der P-Wert für Lebend-Tot-Verhältnisse 2,96E-06 (WT vs. ΔTS), 1,33E-13 (WT vs. ΔBP), P-Wert für Pelletgröße = 2,9E-31 (WT vs. ΔTS). ), 1.1E-26 (WT vs. ΔBP). In (c) beträgt der P-Wert für Lebend-/Totverhältnisse = 8,2E-05 (WT vs. ΔTS), 9,5E-08 (WT vs. ΔBP), P-Wert für Pelletgröße = 4,9E-20 (WT vs. ΔTS). ), 4.2E-17 (WT vs. ΔBP). Die für jedes Panel gezeigten Bilder sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Maßstabsbalken = 100 µm. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Rolle des AAA + ATPase-Proteins bei der eCIS-Funktion zu untersuchen, führten wir das gleiche Experiment wie oben beschrieben mit dem Mutantenstamm ∆ATPase Sco durch. Obwohl dieser Stamm eCIS-Partikel mit normalem Aussehen produziert, ähnelten die von diesem Stamm nach 54-stündigem Wachstum in flüssigen Medien produzierten Myzelpellets denen der eCIS-defizienten Mutantenstämme. Diese Pellets waren ungefähr halb so groß wie die WT-Pellets und zeigten die halbe Häufigkeit des Zelltods (ergänzende Abbildung 4b). Dieser Trend setzte sich zum Zeitpunkt 74 Stunden fort (ergänzende Abbildung 4c). Wie bei den anderen eCIS-defizienten Mutanten ähnelten die Myzelpellets des ∆ATPase-Stammes nach 48-stündigem Wachstum dem WT (ergänzende Abbildung 4a). Diese Daten zeigen, dass das Vorhandensein schwanzartiger Partikel allein nicht den Zelltod auslöst und dass die ATPase eine Funktion ausübt, die für die biologische Aktivität der eCIS-Partikel erforderlich ist.

Sco folgt einem Entwicklungsprogramm, das durch einen Übergang von der Bildung vegetativer Hyphen zu Lufthyphen gekennzeichnet ist, gefolgt von der Sporenbildung. Um festzustellen, ob das Fehlen von eCIS dieses Programm stören könnte, haben wir das Wachstum der WT- und ∆TS-Stämme auf festen Medien verglichen. In frühen Wachstumsstadien ergab die visuelle Untersuchung der Agarplatten keine signifikanten Unterschiede, da alle Stämme ähnliche vegetative Rasen produzierten. Nach 48 Stunden hatten sich die eCIS-Mutanten jedoch hinsichtlich der Produktion des pigmentierten Sekundärmetaboliten Actinorhodin sichtbar schneller entwickelt (Abb. 4a, oberes Feld). Zu späteren Zeitpunkten verschwanden alle sichtbaren Unterschiede und nach 72 Stunden hatten alle Stämme vergleichbare Rasen aus Luftmyzelien entwickelt (Abb. 4a, unteres Feld). In flüssigen Medien beobachteten wir, dass WT- und eCIS-defiziente Stämme ähnliche Wachstumsraten aufwiesen (ergänzende Abbildung 5).

Eine 108 SFU des Sco-Wildtyps (WT), zwei unabhängig isolierte Schwanzscheiden-Knockout-Stämme (ΔTS_1 und ΔTS_2) oder ein Grundplatten-Knockout-Stamm (ΔBP) wurden auf R2YE-Agar ausplattiert. Das obere Feld zeigt repräsentative Bilder der Entwicklung von Sekundärmetaboliten in Rasenflächen, die 48 Stunden lang gewachsen sind. Das untere Feld zeigt die Lufthyphenentwicklung auf den gleichen Platten wie oben, nach 72 Stunden. b Repräsentative Transmissionslichtmikroskopaufnahmen von Oberflächenabdrücken auf Deckgläsern von auf Agar gewachsenen Rasenflächen der Mutantenstämme WT Sco, ΔTS oder ΔBP 42 und 55 Stunden nach der Keimung. Die Lufthyphen und Sporen haften am Deckglas, nicht jedoch die vegetativen Hyphen. Für jede Probe werden zwei Felder angezeigt. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit zwei biologischen Replikaten pro Stamm. Maßstabsbalken = 20 µm. c Die in (b) beschriebene Lufthyphendichte der Oberflächenabdrücke auf Deckgläsern wurde durch Bildanalyse lichtmikroskopischer Aufnahmen quantifiziert (n = 6 Proben, gemessen für jeden Stamm und zu jedem Zeitpunkt). Diagramme zeigen den Mittelwert mit Fehlerbalken, die die Standardabweichung des Mittelwerts darstellen. Die mittleren Dichtewerte von eCIS-Mutanten wurden mit WT unter Verwendung eines t-Tests mit zwei Stichproben verglichen. Es werden zweiseitige P-Werte angezeigt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. P-Werte = 0,0009, 0,0003 und 0,0024 für ΔTS_1-, ΔTS_2- und ΔBP-42-h-Hyphenproben. P-Werte = 0,0012, 0,0003 und 0,0148 für ΔTS_1-, ΔTS_2- und ΔBP-55-h-Hyphenproben.

Es ist zu beachten, dass die Produktion von Actinorhodin durch eCIS-defiziente Stämme je nach verwendeten Medien unterschiedlich war. Unter bestimmten Bedingungen des Wachstums flüssiger oder fester Medien produzierten diese Mutanten erheblich weniger Pigment als WT (ergänzende Abbildung 6a – c). Da die Regulierung der Actinorhodin-Produktion kompliziert ist27,28,29,30,31, ist es schwierig, diese variablen Effekte zu erklären. Die Störung der Produktion von Sekundärmetaboliten ohne eCIS steht jedoch im Einklang mit der Rolle, die eCIS im Entwicklungsprogramm spielt.

Wir verwendeten einen Mikroskopie-Ansatz, um eine klarere Einschätzung der Bildung von Lufthyphen zu mittleren Zeitpunkten im Entwicklungsprogramm zu erhalten. Wir haben Glasdeckgläser auf die Oberfläche des wachsenden Bakterienrasens aufgebracht. Da die Oberfläche der Deckgläser hydrophob ist, haften nur Lufthyphen daran, die über eine hydrophobe Beschichtung verfügen. Anhaftende Hyphen wurden dann durch mikroskopische Untersuchung entdeckt. Bis zu 35 Stunden nach der Keimung waren in keiner der Proben Zellen auf Deckgläsern zu sehen, die auf die Rasenoberfläche aufgetragen worden waren. Nach 42 Stunden hatten die WT-Stämme noch keine sichtbaren Lufthyphen produziert, während die ∆TS- und ∆BP-Mutantenstämme gut entwickelte Lufthyphenstränge zeigten, die in zahlreichen Regionen auf dem Objektträger gebündelt waren (Abb. 4b, c). Dieser Trend setzte sich nach 55 Stunden Wachstum fort, wobei die WT-Stämme im Vergleich zu den eCIS-defizienten Mutanten, die größere, stärker entwickelte Hyphencluster aufwiesen, einige verstreute Hyphenstränge entwickelt hatten (Abb. 4b, c).

Da das Fehlen von eCIS das Sco-Entwicklungsprogramm zu stören schien, fragten wir uns, ob die für eCIS kodierenden Gene in einem entwicklungsregulierten Muster exprimiert wurden. Zu diesem Zweck haben wir vier bekannte Promotoren der eCIS-Region (Abb. 1b; ergänzende Abb. 7) mit Plasmid-basierten Genen fusioniert, die für die Luciferase-Aktivität (luxCDABE) kodieren. Die Einführung dieser Plasmide in WT Sco ergab, dass alle vier eCIS-Promotoren aktiv waren und das gleiche zeitliche Expressionsmuster aufwiesen (Abb. 5). Dieses Muster ähnelte dem Promotor des Haupt-Sigma-Faktor-Gens hrdB33, das während des vegetativen Wachstums wirkt, und dem Promotor von redD. Dieses Gen kodiert für den Transkriptionsregulator des roten Biosyntheseclusters, der in den frühen Stadien des Entwicklungsschalters transkribiert wird34,35. Diese Ergebnisse zeigen, dass die eCIS-Operons während der vegetativen Wachstumsphase unter normalen Wachstumsbedingungen exprimiert werden, direkt vor dem Entwicklungswechsel, der zur Bildung und Sporulation von Lufthyphen führt.

Ein Fusionskonstrukt jedes eCIS-Promotors (eCISp1-p4, entsprechend den in Abb. 1b gezeigten Promotoren P1-P4) mit luxCDABE wurde mit Sco konjugiert und 7 Tage lang auf MS-Agarplatten mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Als Kontrollen wurden die Reporterstämme hrdBp und redDp verwendet. Die Lumineszenz wurde dreimal täglich gemessen. Die Aktivität der schwächeren Promotoren: eCISp1, eCISp2 und eCISp3 ist in der oberen rechten Einfügung in vergrößerter Ansicht dargestellt. Für jeden Assay wurden drei biologische Replikate getestet (n = 3). Der auf den leeren Vektor normierte Mittelwert wird mit Fehlerbalken angezeigt, die die Standardabweichung des Mittelwerts darstellen. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Unser beobachtetes Transkriptionsmuster für die eCIS-Promotoren stimmt mit früheren Beobachtungen überein, dass die eCIS-Expression durch bldA36,37,38 reguliert wird. Dieses Gen ist für die ordnungsgemäße morphologische Entwicklung, den Sekundärstoffwechsel und die Sporulation erforderlich39,40,41. Es kodiert die einzige tRNA für das seltene Leucin-Codon TTA, das in 2–3 % der Streptomyces-Gene vorhanden ist. Die Produktion des mutmaßlichen eCIS-Transkriptionsregulators, der von sco4263 kodiert wird, ist von BldA abhängig, da es ein TTA-Codon enthält. Wir analysierten 56 Streptomyces-eCIS-Regionen und stellten fest, dass 42 mindestens ein Gen enthielten, das ein TTA-Codon im Leserahmen enthielt. Von den identifizierten TTA-haltigen Genen sind 22 mutmaßliche eCIS-Regulationsgene (Ergänzungsdaten 1 und 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eCIS-Regionen häufig durch bldA reguliert werden, was sicherstellt, dass sich eCIS-Partikel im Zusammenhang mit dem morphogenetischen Übergang ansammeln.

Um die Frage zu beantworten, ob eCIS möglicherweise eine gemeinsame Funktion für viele Streptomyces-Arten erfüllt, haben wir versucht, konservierte Merkmale zu identifizieren, die speziell für Streptomyces eCIS gelten. Zu diesem Zweck durchsuchten wir öffentlich zugängliche Streptomyces-Genome und identifizierten 153 eCIS-kodierende Regionen in 127 Streptomyces-Genomen (Supplementary Data 3). eCIS wurden zuvor basierend auf Sequenzähnlichkeit und Genanordnung in 6 verschiedene Subtypen eingeteilt3. Die Mehrheit (>80 %) der Streptomyces-Arten, einschließlich Sco, kodieren ein Typ-IId-eCIS, wie bereits erwähnt3; Daher gehen wir davon aus, dass jede konservierte eCIS-Funktion von diesem Typ ausgeführt werden muss.

Die meisten eCIS-Regionen kodieren Proteine mit Domänen, die mit der Toxinaktivität assoziiert sind. Es wird angenommen, dass diese Proteine in das eCIS-Partikel eingebaut und in Zielzellen injiziert werden, um die Zelltötung zu bewirken10,42,43. Wir konnten kein Protein identifizieren, das häufig in den eCIS-Regionen von Streptomyces kodiert wird und eine identifizierbare Toxindomäne enthielt. Eine BLAST44-Suche mit dem Sco4256-Protein, von dem wir fanden, dass es ein Bestandteil des Sco-eCIS-Partikels ist (Ergänzungstabelle 1), ergab jedoch eng verwandte Proteine, die in 90 % der 105 Streptomyces-Klasse-IId-eCIS kodiert sind (Ergänzungsdaten 4). Die Ausrichtung einer repräsentativen Gruppe von Sequenzen und die Strukturanalyse mit HHpred45 legten eine Drei-Domänen-Architektur nahe, wobei die zweite Domäne voraussichtlich eine Transmembran-Helix-Region ist (Abb. 6a; ergänzende Daten 5). Die erste Domäne, die in allen Homologen vorhanden ist, weist mit hoher Wahrscheinlichkeit Ähnlichkeiten mit periplasmatischen Chaperonen auf, die neben anderen Strukturen und Familien an der Pilus-Assemblierung beteiligt sind (Supplementary Data 5). Ungefähr ein Drittel der Homologen, einschließlich des von Sco, besitzen eine C-terminale dritte Domäne mit Ähnlichkeit zu verschiedenen Bakterientoxinen und hämolytischen Lektinen (Abb. 6b; Ergänzende Daten 5). Diese Proteine können von eCIS als toxische Fracht geliefert werden. Interessanterweise wurden Homologe dieser Proteine auch in eCIS-Regionen der Klasse IId in Genomen anderer Actinobakterienarten und mehrerer Arten filamentöser Cyanobakterien und Chloroflexi identifiziert (Abb. 6a; Ergänzende Daten 4). Proteine mit hochsignifikanter Ähnlichkeit zu Sco4256 wurden selten in nicht für eCIS kodierenden Regionen gefunden.

a Eine vielfältige Auswahl an Treffern aus einer BLAST-Suche, die mit Sco4256, dem mutmaßlichen Toxin, gestartet wurde, wurde von HHpred abgeglichen und analysiert. Die gezeigten Sequenzen stammen von Streptomyces-Arten (unschattiert), anderen Actinomyceten-Arten (grau schattiert), Cyanobakterien (grün schattiert) und Chorflexi (gelb schattiert). Alle Proteine sind mit Systemen vom Typ IId assoziiert und alle Gattungen außer Cyanothece sind filamentös. b Ein Schema der konservierten Domänen von Proteinen im Zusammenhang mit Sco4256 wird gezeigt. c Eine vielfältige Auswahl von Treffern aus einer BLAST-Suche, die mit Sco4242, der mutmaßlichen Faser, initiiert wurde, wurde abgeglichen. Die gezeigten Sequenzen stammen von Streptomyces-Arten (unschattiert) und anderen Actinomyceten-Arten (grau schattiert). Diese Proteine kommen im eCIS vom Typ IId vor. Alle Ausrichtungen wurden mit MUSCLE62 durchgeführt, wie in Jalview63 implementiert. Es wurde das Cluster-Farbschema verwendet.

Strukturell charakterisierte eCIS5,13,20 und kontraktile Phagenschwänze1 weisen Faserproteine auf, die an ihren Grundplatten befestigt sind. Bei Phagen vermitteln diese Fasern die Anheftung an Wirtszellen. In den meisten Phagengenomen mit kontraktilem Schwanz und in den Genomen charakterisierter eCIS8,11,13,14 werden Faserproteine unmittelbar stromabwärts von Genen kodiert, die für die Grundplattenkeilproteine BW2 und BW3 kodieren. In der Sco-eCIS-Region wurde festgestellt, dass das Proteinprodukt des Gens an dieser Position (sco4242) (Abb. 1b) ein Bestandteil des eCIS-Partikels ist (Ergänzungstabelle 1). Eine BLAST-Suche mit diesem Protein ergab eng verwandte Homologe in 75 % der eCIS-Regionen der Klasse IId in Streptomyces und im eCIS der Klasse IId anderer Actinomyceten-Arten (Abb. 6c; ergänzende Daten 6). Die Ausrichtung dieser Proteine zeigte eine konservierte C-terminale Region mit einer Länge von etwa 150 Resten, der ein stark vorhergesagtes Transmembranmotiv vorausgeht (Abb. 6c). Die C-terminale Domäne weist eine starke Ähnlichkeit mit kohlenhydratabbauenden Domänen auf, wie von HHpred vorhergesagt (Supplementary Data 7). Da rezeptorbindende Proteine von Phagen, zu denen Fasern eine Gruppe sind, häufig an Kohlenhydrate auf der Bakterienzelloberfläche binden oder diese abbauen, stimmen diese vorhergesagten Funktionen des Sco4242-Proteins mit seiner Funktion als bakterielles Zelloberflächenbindungsprotein überein. Die konservierte Domäne 2, die etwa 50 Reste unmittelbar vor dem Transmembransegment umfasst, ist Cys-reich und könnte eine Zn-bindende Domäne sein, wie von HHpred vorhergesagt (Supplementary Data 7). Diese Region könnte die Anlagerung dieser Proteine an die Grundplatte vermitteln. Zusammenfassend zeigen unsere bioinformatischen Daten (zusammengefasst in den Zusatzdaten 1), dass die meisten eCIS von Streptomyces Typ IId verwandte mutmaßliche Faser- und Toxinproteine gemeinsam haben, was eine gemeinsame Funktion von eCIS in dieser Gattung unterstützt.

eCIS-Partikel werden von Bakterienarten in sehr unterschiedlichen Bakteriengruppen produziert. Das verstreute Vorkommen von eCIS und ihre nachgewiesene Rolle bei der Vermittlung toxischer Aktivitäten gegen eukaryotische Zellen haben dazu geführt, dass diese Systeme als Abwehrmechanismen angesehen werden, die unter bestimmten Bedingungen nützlich, aber für die normale Zellfunktion nicht von zentraler Bedeutung sind. Die hier vorgestellten Ergebnisse weisen auf eine völlig besondere Rolle von eCIS in Sco hin, wo sie offenbar am Entwicklungsprozess dieser Art beteiligt sind. Insbesondere haben wir gezeigt, dass Sco im Rahmen seines normalen Wachstumszyklus eCIS-Partikel produziert und dass Stämme, denen funktionelle eCIS-Partikel fehlen, deutliche Veränderungen in ihrem Entwicklungsprogramm aufweisen. Zu diesen Veränderungen gehörten Störungen der Antibiotikaproduktion während des Wachstums auf festen und flüssigen Medien (Abb. 4a; ergänzende Abb. 6) und eine beschleunigte Entwicklung von Lufthyphen auf festen Medien (Abb. 4b, c). Am interessantesten ist, dass eCIS-defiziente Mutanten während des Flüssigkeitswachstums einen deutlich geringeren Zelltod und eine veränderte Morphologie aufwiesen (Abb. 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Sco eCIS funktioniert, indem es Letalität innerhalb des Stammes induziert, was möglicherweise eine Rolle im Entwicklungsprozess spielt.

Im Gegensatz zu einer früheren Studie zu Streptomyces lividans konnten wir keine eCIS-vermittelte Hemmung des Wachstums von S. cerevisiae durch Sco22 feststellen. Da die eCIS dieser beiden Arten sehr eng miteinander verwandt sind, würden wir erwarten, dass sie die gleiche Funktion erfüllen. Es ist möglich, dass wir die wachstumshemmende Aktivität des Sco eCIS nicht erkannt haben, weil wir einen anderen Assay verwendet haben, der möglicherweise nicht so empfindlich ist wie der in der anderen Studie verwendete. Da wir außerdem komplizierte Veränderungen in der Antibiotikaproduktion durch die eCIS-defizienten Stämme beobachteten, ist es möglich, dass indirekte Auswirkungen auf die Antibiotikaproduktion die in der vorherigen Studie beobachteten Auswirkungen verursachten. Diese Idee wird durch das Fehlen einer S. cerevisiae-Wachstumshemmung durch den Stamm M1152 (Abb. 2a) gestützt, der die vier wichtigsten Sco-Antibiotika nicht produziert. Casu et al.46 fanden kürzlich auch heraus, dass Sco eCIS keine Rolle bei der Hemmung des Wachstums anderer Bakterienarten oder von S. cerevisiae spielte.

Während intrazelluläre Sco-Lysate größtenteils vollständig umhüllte eCIS-Strukturen mit typischem Aussehen aufwiesen (Abb. 1c), enthielten extrazelluläre Proben fast ausschließlich leere, kontrahierte Hüllenarten (Abb. 1e). Dieser starke Unterschied zwischen den intrazellulären und extrazellulären Pools von eCIS-abgeleiteten Strukturen deutete darauf hin, dass eCIS nicht durch generalisierte Lyse aus den Zellen entweicht, eine Schlussfolgerung, die auch durch das Fehlen von ActR, einem zytoplasmatischen Protein, in den extrazellulären Fraktionen, die Hüllproteine enthalten, gestützt wird (ergänzende Abb . 1b, d). Ein Modell, das die obige Beobachtung erklären könnte, ist, dass in intakten Myzelien die schwanzähnlichen Strukturen membrangebunden sind. Beim Auftreffen auf den entsprechenden Reiz kann sich das eCIS durch die Membran ausdehnen, um eine benachbarte Zelle zu kontaktieren, was zu einer Kontraktion und Freigabe der kontrahierten Hülle führt. Die Sco-eCIS sind mit einer Länge von 300 nm erheblich länger als andere eCIS, die etwa 120 nm lang sind5,14,20 und Phagen mit kontraktilem Schwanz, die grampositive Bakterien infizieren, besitzen Schwänze von bis zu 200 nm Länge47. Somit ist ein membrangebundenes Sco-eCIS theoretisch lang genug, um durch die Membran und Zellwand seiner Wirtszelle zu dringen und eine nahegelegene Zelle zu kontaktieren. Die Möglichkeit, dass Sco eCIS an die Zellmembran gebunden ist, wird auch durch das konservierte Vorhandensein einer stark vorhergesagten Transmembranhelix in seinem mutmaßlichen Faserprotein gestützt (Abb. 6c). In einer kürzlich durchgeführten Studie an Anaboena, einem filamentösen Cyanobakterium, wurde gezeigt, dass die eCIS-Strukturen durch eine Transmembranhelix in einem faserähnlichen Protein, das an der Grundplatte befestigt war, an der Thylakoidmembran verankert sind13. Obwohl wir keine Fasern auf den Sco eCIS-Partikeln beobachteten, konnten wir das mutmaßliche Faserprotein in unseren gereinigten Proben durch Massenspektrometrie nachweisen (Ergänzungstabelle 1). Die Bedingungen der Zelllyse während der Reinigung würden wahrscheinlich die Membranwechselwirkungen stören und die Fasern in variablen Konformationen zurücklassen, die durch TEM möglicherweise schwer zu unterscheiden wären.

Ein weiterer Wirkmechanismus für Sco eCIS wurde von Casu et al.46 vorgeschlagen. Mithilfe der Kryoelektronentomographie (CryoET) beobachteten sie frei schwebende ausgedehnte eCIS ausschließlich innerhalb intakter Hyphen. In teilweise lysierten Hyphen sahen sie eine Mischung aus verlängertem und kontrahiertem eCIS, während Geisterzellen, bei denen es sich um membranlose Zellen handelt, die nur eine Peptidoglycanschicht aufweisen, nur kontrahiertes eCIS enthielten. Sie kamen zu dem Schluss, dass die eCIS-Wirkung, die eine Kontraktion der Hülle beinhaltet, eine Lyse aus dem Inneren der Zellen verursacht. Unsere Daten stimmen auch mit diesem Modell überein, da wir davon ausgehen, dass ActR nicht ohne weiteres aus Geisterzellen entweicht oder dass nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen während des Zeitraums der ActR-Induktion in unseren Experimenten (45 Minuten) lysiert wurde.

Eine mögliche Einschränkung unserer Studie besteht darin, dass einige Schlüsselexperimente, beispielsweise zur Untersuchung des Zelltods, in Flüssigkulturen durchgeführt wurden, in denen Sco nicht sporuliert. Es wurde jedoch gezeigt, dass das Entwicklungsprogramm in Bezug auf die Genexpression in flüssigem und festem Medium ähnlich ist48,49. Daher gehen wir davon aus, dass es während des Wachstums auf festen Medien zu entsprechenden Unterschieden kommt, bei denen nachweislich auch Zelltod auftritt50,51,52.

Der vegetative Hyphenabbau während der Entwicklung ist seit langem als Merkmal der Entwicklung von Streptomyceten bekannt53 und in jüngerer Zeit wurde postuliert, dass der programmierte Zelltod als Teil des Übergangs vom vegetativen zum Luftmyzelwachstum auftritt25,50,54. Es wird angenommen, dass ein koordiniertes Stadium des Zelltods, das auf einen Teil der vegetativen Hyphenpopulation während der Entwicklung beschränkt ist, dazu dienen kann, dem wachsenden reproduktiven Luftmyzel zusätzliche Nährstoffe zuzuführen, und tote Hyphen könnten auch eine strukturelle Rolle spielen oder den Nährstofftransport erleichtern51,52,55 ,56. In Übereinstimmung mit einer Rolle in dieser Phase des Sco-Lebenszyklus haben wir gezeigt, dass die eCIS-Expression spät in der vegetativen Wachstumsphase in einem zeitlichen Muster ihren Höhepunkt erreicht, das dem Antibiotika-Regulator-Gen redD ähnelt. Die Notwendigkeit von BldA, einem Hauptregulator des morphogenetischen Schalters, für die Expression der Sco-eCIS-Gene unterstützt ebenfalls eine Rolle in diesem Prozess. Der offensichtliche Bedarf an bldA für die Expression von eCIS-Genen in vielen Streptomyces-Arten sowie die Erhaltung mutmaßlicher Effektor- und Faserproteine in vielen Streptomyces-eCIS-Regionen legen nahe, dass diese eCIS möglicherweise eine konservierte Funktion beim programmierten Zelltod haben. Diese gemeinsame Funktion im Lebenszyklus der Streptomyces würde das sehr häufige Auftreten von eCIS in dieser Gruppe erklären. Interessanterweise wurde kürzlich eine Rolle beim Zelltod innerhalb des Stammes für das eCIS von Anabaena vorgeschlagen, das ebenfalls einen komplexen Lebensstil hat13. Wir fanden heraus, dass das eCIS verschiedener Actinomyceten und anderer filamentöser Cyanobakterien Homologe des mutmaßlichen Effektorproteins Sco4256 kodiert, was einen weiteren Zusammenhang zwischen der eCIS-Funktion in diesen beiden filamentösen Bakteriengruppen herstellt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine Funktion von eCIS bei der Vermittlung der Zellletalität innerhalb eines Stammes aufgezeigt hat, die sich auf den Entwicklungsprozess von Streptomyces auswirkt, was bestätigt, dass eCIS eine bakterizide Aktivität besitzen und am normalen Lebenszyklus einer Bakterienart teilnehmen kann.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme, Plasmide und Cosmide sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Alle verwendeten Streptomyces-Stämme waren Derivate von Streptomyces coelicolor A3(2). Sco-Stämme wurden 3 Tage lang bei 30 °C auf Maltose-Hefeextrakt-Malzextrakt (MYM)-Agarmedium57 oder in Hefeextrakt-Malzextrakt (YEME)-Flüssigmedium58 unter kontinuierlichem Rühren 3 Tage lang gezüchtet, sofern nicht anders angegeben. Andere Bakterienstämme wurden in Lysogeny Broth (LB)-Medium oder Agar (pH 7,0) bei 37 °C gezüchtet, sofern nicht anders angegeben. Saccharomyces cerevisiae wurden in YPD-Medium oder Agar (pH 7,0) bei 30 °C gezüchtet.

Die eCIS-Promotorsequenzen wurden aus genomischer Wildtyp-DNA von Sco M145 unter Verwendung der Primer SCO_eCISp1p2GEN und SCO_eCISp3p4GEN amplifiziert (Ergänzungstabelle 4). Die resultierenden PCR-Fragmente wurden als Matrize verwendet, um eine EcoRV-Blunt-Cut-Stelle unter Verwendung der Primer SCO_eCISp1p2EcoRV und SCO_eCISp3p4EcoRV einzuführen. Die PCR-Produkte wurden in der Vorwärts- und Rückwärtsorientierung in die EcoRV-Stelle des pFlux-Plasmids32 kloniert, um beide Transkriptionsrichtungen der divergenten Promotorregionen testen zu können. Alle Plasmide wurden durch Sequenzierung verifiziert. Die resultierenden Reporterplasmide pFlux-eCISp1-p4 wurden in methylierungsdefiziente E. coli ET12567/pUZ8002-Zellen elektroporiert58. Plasmide wurden durch intergene Konjugation und Selektion auf Apramycin (50 µg/ml) in Wildtyp-Sco eingeführt58.

Für Lumineszenztests wurden 104 sporenbildende Einheiten (SFU) jedes Sco-Reporterstamms in 10 µl Kochsalzlösung resuspendiert und dreifach auf 200 µl Soja-Mannitol (MS)-Agar59 in Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Die Platten wurden 7 Tage lang bei 30 °C inkubiert und die Lumineszenz wurde dreimal täglich mit einem PerkinElmer Victor X Multilabel-Plattenlesegerät gemessen.

Um genomische Ersetzungen der eCIS-Schwanzscheide-, Grundplatten- und ATPase-kodierenden Gene zu schaffen, wurde die REDIRECT-Methode für das PCR-Targeting in Streptomyces wie beschrieben eingesetzt58. Die aac3(IV)-oriT-Kassette, die Resistenz gegen Apramycin verleiht, wurde unter Verwendung der Primerpaare SCO4253_Disrp, SCO_BP_Disrp bzw. SCO4259_Disrp amplifiziert (Ergänzungstabelle 4). Die amplifizierten Kassetten wurden verwendet, um die jeweiligen eCIS-Gene im Cosmid StD8a60 zu ersetzen. Die resultierenden Cosmide (in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt) wurden durch Konjugation aus dem nicht methylierenden E. coli-Stamm ET12567/pUZ800258 in den Wildtyp-Stamm M145 eingeführt, um Apramycin-resistente Exkonjuganten zu erhalten. Zur Selektion auf Double-Cross-Over-Exkonjuganten wurden die Aparamycin-resistenten Kolonien auf Kanamycin-Resistenz untersucht. Für jedes Gen wurden drei ApraR KanS-Exkonjugantenstämme ausgewählt, die aus separaten Konjugationsereignissen resultierten. Mutantenstämme wurden durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden bestätigt; StD8aΔTS_aac(3)IV, StD8aΔBP_aac(3)IV bzw. StD8aΔATP_aac(3)IV (Ergänzungstabelle 4) und durch DNA-Sequenzierung.

Wildtyp-Sco M145 oder Sco Δsco4253 (ΔTS) wurden experimentell dreifach in R2YE-Flüssigmedien mit einer Endkonzentration von 1,5 × 106 SFU/ml inokuliert. Die Kulturen wurden unter Rühren 22 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet. Alle Kulturen wurden auf eine OD450 von 0,5 standardisiert. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 3500 × g gewonnen, in Kochsalzlösung resuspendiert und erneut 10 Minuten bei 3500 × g zentrifugiert. Zellpellets wurden in 50 ml frischem RG2-Minimalmedium resuspendiert. Die Kulturen wurden 94 Stunden lang unter ständigem Schütteln bei 30 °C inkubiert. Zum visuellen Vergleich der Pigmentproduktion wurden Bilder der wachsenden Kulturen mit einer NIKON D3000-Kamera an einer festen Position innerhalb eines Lichtkastens zu den Zeiten 0, 18 Stunden, 24 Stunden, 41 Stunden, 49 Stunden, 65 Stunden, 70 Stunden usw. aufgenommen 94 Std. Zur Quantifizierung der gesamten Actinorhodin-Produktion wurden zu den oben angegebenen Zeitpunkten 480-µl-Proben gesammelt. 120 µl 5 M KOH wurden bis zu einer Endkonzentration von 1 M zugegeben und die Proben wurden gevortext und 5 Minuten lang bei 3000 × g zentrifugiert. Die Absorption des Überstands bei 640 nm wurde unter Verwendung einer Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen abgelesen. Jeder Test wurde auf das Gewicht des Pellets standardisiert.

108 SFU von Sco-Wildtyp- oder eCIS-defizienten Mutantenstämmen im biologischen Duplikat wurden auf R2YE-Agarplatten ausplattiert und bei 30 °C gezüchtet. Ab 24 Stunden nach der Keimung wurden in Abständen von etwa 12 Stunden sterile Glasdeckgläser vorsichtig auf die Oberfläche jedes Bakterienrasens aufgetragen. Deckgläser wurden auf einem Objektträger aus Mikroskopglas versiegelt und unter Verwendung eines Zeiss-Durchlichtmikroskops bei 40-facher Vergrößerung untersucht. Die Bilder wurden anschließend mit Adobe Photoshop CS6 v.13.0 analysiert. Der Hintergrund wurde auf eine leere WT-Folie normalisiert und die Gesamtpixeldichte für jedes Bild berechnet. Es wurde ein t-Test mit zwei Proben unter der Annahme gleicher Varianz durchgeführt, um die mittlere Hyphendichte jeder eCIS-Mutante mit dem Mittelwert der WT-Probe zu vergleichen.

Sporen (105 SFU, suspendiert in 5 µL 0,85 %iger Kochsalzlösung) der Wildtyp-Sco M145, M1152 oder der eCIS-Mutantenstämme ΔTS oder M1152 ΔTS wurden auf R2YE-Agarplatten getupft. Die Platten wurden 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert, bevor sie mit 5 ml geschmolzenem, extraweichem LB-Agar (0,5 % Agar) überschichtet wurden, der die zu testenden Organismen enthielt (bei einer endgültigen OD600 im Bereich von 0,01–0,1). Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert und die antimikrobielle Aktivität wurde durch Messung der Clearance-Zonen im Indikatorrasen bewertet. Die Oberfläche der durch Sco M145-Stämme induzierten Clearance-Zonen wurde mit ImageJ v. 1.53 quantifiziert. Tests gegen Streptomyces-Stämme wurden durchgeführt, indem eine 3-Tage-Kolonieplatte mit 1 ml 0,85 %iger Kochsalzlösung, die 5 µL konzentrierter Streptomyces-Sporen enthielt, überschichtet wurde. Die Platten wurden 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert, bevor die antimikrobielle Aktivität beurteilt wurde. Tests gegen Saccharomyces cerevisiae wurden durchgeführt, indem eine 4-Tage-Kolonieplatte mit 5 ml geschmolzenem, extraweichem YPD-Agar mit S. cerevisiae (bei einem endgültigen OD600-Wert im Bereich von 0,05–0,2) überschichtet wurde. Die Platten wurden über Nacht bei 30 °C inkubiert.

Die TS- und BW1-Proteine wurden aus E. coli exprimiert und gereinigt. Gene, die das BW1-Protein (sco4245) und das TS-Protein (sco4253) kodieren, wurden aus genomischer Sco-DNA in die BseR1-Stelle des p15TV-L-Vektors unter Verwendung des In-fusion HD-Klonierungskits (Clonetech) unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführten Primer kloniert. Verifiziert Plasmide wurden in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) transformiert, bei 37 °C mit geeigneten Antibiotika bis zu einer OD600 von 0,6 gezüchtet und die Proteinexpression mit 1 mM IPTG induziert. Die Kulturen wurden 16–18 Stunden lang bei 17 °C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol (βME)) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert. Die Lysate wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 25.000 × g und 4 °C geklärt. Die Proteine wurden durch 30-minütige Inkubation mit 2 ml Ni-NTA-Agaroseharz (Invitrogen) bei 4 ° C affinitätsgereinigt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur durch eine Säule geleitet und ausgiebig mit Bindungspuffer, der 30 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Gebundene Proteine wurden mit Bindungspuffer, der 300 mM Imidazol enthielt, eluiert und über Nacht bei 4 °C in Puffer dialysiert, der Folgendes enthielt: 20 mM Tris·HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 % (Vol./Vol.) Glycerin, 1 mM DTT. Die Proben wurden mit Vivaspin-Filterkonzentratoren (Sigma-Aldrich) konzentriert und mit einer Superdex200 16/60-Größenausschlusssäule auf einem ÄKTA-Schnellleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (GE Healthcare) weiter aufgetrennt. Relevante Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und verifiziert und auf eine Endkonzentration von 0,1 – 0,25 mg/ml konzentriert.

Polyklonale Maus-Antikörper wurden großzügigerweise vom Gray-Owen-Labor an der University of Toronto erzeugt. Frisches gereinigtes Protein in einer Konzentration von 0,05–0,25 mg/ml wurde mit 100 µl Emulsigen-Adjuvans gemischt und Mäusen injiziert. Eine zweite Auffrischungsdosis wurde 21 Tage später verabreicht. Antiseren wurden am 35. Tag gesammelt. Die Spezifität der Antiseren wurde durch Western-Blot-Analyse mit geeigneten Kontrollen getestet. Quelldaten und Validierung werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Sco-Stämme wurden 4 Tage lang bei 30 °C auf MYM-Agar gezüchtet. 1 cm2 große Agarquadrate, die Myzel und Sporen enthielten, wurden aus der Platte herausgeschnitten und direkt in 50 ml YEME-Flüssigmedium überführt. Die Zellen wurden für die angegebenen Zeiträume unter Schütteln bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und aus dem Überstand wurde eine extrazelluläre Probe (E) entnommen. Die Pellets wurden in 10 % Saccharose gewaschen und erneut zentrifugiert, in 16 ml Puffer P61, ergänzt mit 2 mg/ml Lysozym, resuspendiert und 1 Stunde bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in Puffer C (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 15 % Vol./Vol. Glycerin, 1 mM DTT, Proteaseinhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich – eine Tablette pro 50 ml Puffer)) resuspendiert beschallt. Die lysierten Zellen wurden 20 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert und der Überstand dann durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. Gefilterte Proben wurden 3 Stunden lang bei 4 ° C mit 150.000 × g geschleudert. Das Pellet wurde in 5 ml eiskaltem 1XPBS resuspendiert. Die Proben wurden auf Säulen mit 5 ml DEAE-Sepharose-Anionenaustauscherharz (Sigma-Aldrich) geladen, gründlich mit PBS gewaschen und mit 0,5 M NaCl in PBS-Puffer eluiert. Die Proben wurden 90 Minuten lang bei 4 °C und 150.000 × g ultrazentrifugiert, und die Pellets wurden in 200 μl eiskaltem PBS resuspendiert und bis zu zwei Wochen bei 4 °C gelagert.

Die Proben wurden im Verhältnis 1:1 mit 2 x SDS-Ladepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8; 4 % SDS; 20 % Glycerin; 200 mM β-Mercaptoethanol (βME); 0,2 % Bromphenolblau) gemischt. Die Proteine wurden auf 12 % Polyacrylamid-SDS-Tris-Tricin-Gelen aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde 1 Stunde lang in 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % Tween (TBS-T) blockiert. Beim Test mit α-eCIS-spezifischen Antikörpern wurde Antiserum in einer Verdünnung von 1:5000 in TBS-T mit 5 % Milch zugesetzt. Alternativ wurde α-FLAG-Primärantikörper (Sigma-Aldrich, F7425) in einer Verdünnung von 1:10.000 hinzugefügt. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Antimaus (IgG-HRP sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) oder Maus-Anti-Kaninchen (IgG HRP sc-2357, Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdünnung von 1:2000 in TBS sondiert -T für 1 Stunde bei Raumtemperatur und unter Verwendung von Chemilumineszenzreagenzien (GE Healthcare) entwickelt.

Gereinigte eCIS-Proben wurden kurz zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und 5 μl Überstand wurden auf frisch glimmentladene, kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter (CF400-CU, 6 nm, 400 Mesh, Electron Microscopy Sciences) aufgetragen. Man ließ die Proben zwei Minuten lang adsorbieren, bevor sie mit Filterpapier abgetupft wurden, und die Gitter wurden zweimal mit gefiltertem destilliertem Wasser gewaschen. Die Gitter wurden 15 Sekunden lang mit 15 μl 2 % Uranylacetat negativ gefärbt. Die Gitter wurden mit einer digitalen CDD-Kamera JEM-1011 (JEOL USA, INC.) (5 Megapixel XR50S, AMT, USA) abgebildet.

Sco-Wildtyp- oder eCIS-Mutantenstämme wurden in 40 ml YEME-Kulturmedium aus frischen Sporen mit einer Dichte von 107 /ml inokuliert und bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Proben von 1 ml wurden 5 Minuten lang bei 8000 × g zentrifugiert, zweimal gewaschen und in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Zum Färben der Zellen wurde das LIVE/DEAD Bac-Light-Bakterienlebensfähigkeitskit (L7012; Invitrogen) verwendet. Die Bakteriensuspension wurde mit 3 µl SYTO 9 und Propidiumiodid (PI)-Nukleinsäurefärbungen im Verhältnis 1:1 vorgemischt. Die Zellsuspension und die Nukleinsäurefärbungen wurden durch Vortexen gemischt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen. 10 µl der Suspension wurden auf einen sauberen Objektträger gegeben und mit einem 18 mm großen quadratischen Deckglas abgedeckt. Die Bilder wurden innerhalb von 30 Minuten nach der Inkubation mit einem Zeiss Axio Imager 2 bei einer Anregung von 488 nm und 568 nm und einer Emission von 530 nm (grün) oder 630 nm (rot) aufgenommen. Die Bilder wurden mit Zeiss Zen Blue, Version 3.0.19154.1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH) analysiert und die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9, Version 9.5.0, durchgeführt.

eCIS-Proben wurden wie oben beschrieben gereinigt. Extrazelluläre Proben wurden nach dem ersten Zentrifugationsschritt bei 7000 × g auf ähnliche Weise aus zellfreien Überständen gereinigt. Gereinigte Proben mit 30–150 µg Gesamtprotein wurden mit DTT reduziert, mit Iodacetamid alkyliert und einem tryptischen Verdau unterzogen. Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometriespektren wurden mit einem linearen Ionenfalleninstrument (Thermo Fisher) (SPARC BioCentre, The Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada) gesammelt. Proteine wurden mit Mascot (Matrix Science, London, UK) identifiziert und in Scaffold Version 5.2.2 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) analysiert. Der Grenzwert für die Proteinidentifizierung wurde auf ein Konfidenzniveau von 95 % festgelegt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Massenspektrometriedaten für gereinigte Sco-eCIS-Proben wurden in der MassIVE-Datenbank unter dem Zugangscode hinterlegt; MSV000091288 [https://doi.org/10.25345/C5CC0V388]. Alle übrigen Daten sind in den Zusatzinformationen, den Zusatzdaten 1-7 und der Quelldatendatei verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Taylor, NMI, van Raaij, MJ & Leiman, PG Kontraktile Injektionssysteme von Bakteriophagen und verwandte Systeme. Mol. Microbiol 108, 6–15 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Geller, AM et al. Das extrazelluläre kontraktile Injektionssystem ist mit Umweltmikroben angereichert und geht mit zahlreichen Toxinen einher. Nat. Komm. 12, 3743 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, L. et al. Genomweite Identifizierung und Charakterisierung einer Superfamilie bakterieller extrazellulärer kontraktiler Injektionssysteme. Cell Rep. 29, 511–521.e512 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rybakova, D. et al. Rolle des Antifeeding-Prophagen (Afp)-Proteins Afp16 bei der Beendigung der Länge des Afp-Tailocins und der Stabilisierung seiner Hülle. Mol. Microbiol 89, 702–714 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, F. et al. Kryo-EM-Struktur und Aufbau eines extrazellulären kontraktilen Injektionssystems. Zelle 177, 370–383.e315 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, D., de Souza, RF, Anantharaman, V., Iyer, LM & Aravind, L. Polymorphe Toxinsysteme: Umfassende Charakterisierung von Transportarten, Verarbeitung, Wirkmechanismen, Immunität und Ökologie mithilfe vergleichender Genomik. Biol. Direkt 7, 18 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Makarova, KS et al. Antimikrobielle Peptide, polymorphe Toxine und Selbst-Nicht-Selbst-Erkennungssysteme in Archaeen: ein unerschlossenes Arsenal für intermikrobielle Konflikte. mBio 10, https://doi.org/10.1128/mBio.00715-19 (2019).

Hurst, MR, Glare, TR & Jackson, TA Klonen von Serratia entomophila-Antifraßgenen – ein mutmaßlich defekter Prophage, der gegen den Grasfresser Costelytra zealandica aktiv ist. J. Bakteriol. 186, 5116–5128 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, G., Dowling, AJ, Gerike, U., ffrench-Constant, RH & Waterfield, NR Photorhabdus-Virulenzkassetten verleihen injizierbare insektizide Aktivität gegen die Wachsmotte. J. Bakteriol. 188, 2254–2261 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vlisidou, I. et al. Die Photorhabdus asymbiotica-Virulenzkassetten liefern Proteineffektoren direkt in eukaryotische Zielzellen. Elife 8, https://doi.org/10.7554/eLife.46259 (2019).

Shikuma, NJ et al. Metamorphose mariner Röhrenwürmer, hervorgerufen durch Anordnungen bakterieller phagenschwanzähnlicher Strukturen. Wissenschaft 343, 529–533 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bock, D. et al. In-situ-Architektur, Funktion und Entwicklung eines kontraktilen Injektionssystems. Wissenschaft 357, 713–717 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weiss, GL et al. Struktur eines Thylakoid-verankerten kontraktilen Injektionssystems in mehrzelligen Cyanobakterien. Nat. Microbiol 7, 386–396 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, J. et al. Identifizierung und Struktur eines extrazellulären kontraktilen Injektionssystems aus dem Meeresbakterium Algoriphagus machipongonensis. Nat. Microbiol 7, 397–410 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chater, KF Eine morphologische und genetische Kartierungsstudie von weißen Koloniemutanten von Streptomyces coelicolor. J. Gen. Microbiol 72, 9–28 (1972).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marie A. Elliot., MJB, Justin R. Nodwell. In Myxobacteria: Multizellulärität und Differenzierung (herausgegeben von David E. Whitworth), 419–439 (ASM Press, 2008).

Flardh, K. & Buttner, MJ Streptomyces Morphogenetik: Analyse der Differenzierung in einem filamentösen Bakterium. Nat. Rev. Microbiol 7, 36–49 (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Buttner, CR, Wu, Y., Maxwell, KL & Davidson, AR Grundplattenmontage des Phagen Mu: Definition der konservierten Kernkomponenten von Phagen mit kontraktilem Schwanz und verwandten Bakteriensystemen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 113, 10174–10179 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hurst, MR, Beard, SS, Jackson, TA & Jones, SM Isolierung und Charakterisierung des Antifeeding-Prophagen Serratia entomophila. FEMS Microbiol Lett. 270, 42–48 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Desfosses, A. et al. Atomare Strukturen eines gesamten kontraktilen Injektionssystems sowohl im gestreckten als auch im kontrahierten Zustand. Nat. Microbiol 4, 1885–1894 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heymann, JB et al. Dreidimensionale Struktur des Toxin-Transportpartikel-Antifeeding-Prophagen von Serratia entomophila. J. Biol. Chem. 288, 25276–25284 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagakubo, T. et al. Phagenschwanzartige Nanostrukturen beeinflussen mikrobielle Interaktionen zwischen Streptomyces und Pilzen. Wissenschaft. Rep. 11, 20116 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gomez-Escribano, JP & Bibb, MJ Engineering Streptomyces coelicolor für die heterologe Expression von Sekundärmetaboliten-Genclustern. Mikro. Biotechnologie. 4, 207–215 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Boulos, L., Prevost, M., Barbeau, B., Coallier, J. & Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Anwendung einer neuen Schnellfärbemethode zur direkten Zählung lebensfähiger und Gesamtbakterien im Trinkwasser. J. Microbiol Methods 37, 77–86 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manteca, A., Alvarez, R., Salazar, N., Yague, P. & Sanchez, J. Myzeldifferenzierung und Antibiotikaproduktion in submersen Kulturen von Streptomyces coelicolor. Anwendungsumgebung. Microbiol 74, 3877–3886 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yague, P., Manteca, A., Simon, A., Diaz-Garcia, ME & Sanchez, J. Neue Methode zur Überwachung des programmierten Zelltods und der Differenzierung in submersen Streptomyces-Kulturen. Anwendungsumgebung. Microbiol 76, 3401–3404 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fernandez-Moreno, MA, Caballero, JL, Hopwood, DA und Malpartida, F. Der Act-Cluster enthält regulatorische und Antibiotika-Exportgene, direkte Ziele für die Translationskontrolle durch das bldA-tRNA-Gen von Streptomyces. Zelle 66, 769–780 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Floriano, B. & Bibb, M. afsR ist ein pleiotropes, aber bedingt erforderliches regulatorisches Gen für die Antibiotikaproduktion in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol 21, 385–396 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aceti, DJ & Champness, WC Transkriptionelle Regulation von Streptomyces coelicolor-Signalweg-spezifischen Antibiotika-Regulatoren durch die absA- und absB-Loci. J. Bakteriol. 180, 3100–3106 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, C., Hindra, Mulder, D., Yin, C. & Elliot, MA Crp ist ein globaler Regulator der Antibiotikaproduktion in Streptomyces. mBio 3, https://doi.org/10.1128/mBio.00407-12 (2012).

Xu, Z., Li, Y., Wang, Y., Deng, Z. & Tao, M. Genomweite Mutagenese verbindet mehrere Stoffwechselwege mit der Actinorhodin-Produktion in Streptomyces coelicolor. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 85, https://doi.org/10.1128/AEM.03005-18 (2019).

Craney, A. et al. Ein synthetischer luxCDABE-Gencluster, der für die Expression in Bakterien mit hohem GC optimiert ist. Nukleinsäuren Res. 35, e46 (2007).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Shiina, T., Tanaka, K. & Takahashi, H. Sequenz von hrdB, einem essentiellen Gen, das den Sigma-ähnlichen Transkriptionsfaktor von Streptomyces coelicolor A3(2) kodiert: Homologie zu den wichtigsten Sigma-Faktoren. Gene 107, 145–148 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, J., Kelemen, GH, Fernandez-Abalos, JM & Bibb, MJ Grün fluoreszierendes Protein als Reporter für räumliche und zeitliche Genexpression in Streptomyces coelicolor A3(2). Mikrobiol. (Lies.) 145, 2221–2227 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Zhou, LH, Li, YQ, Li, YQ & Wu, D. Räumlich-zeitliche Expression des signalwegspezifischen regulatorischen Gens redD in S. coelicolor. J. Zhejiang Univ. Wissenschaft. B 6, 464–469 (2005).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hackl, S. & Bechthold, A. Das Gen bldA, ein Regulator der morphologischen Differenzierung und Antibiotikaproduktion in Streptomyces. Bogen. Pharm. (Weinh.) 348, 455–462 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Hesketh, A. et al. Neue pleiotrope Effekte der Eliminierung einer seltenen tRNA aus Streptomyces coelicolor, aufgedeckt durch kombinierte proteomische und transkriptomische Analyse von Flüssigkulturen. BMC-Genom. 8, 261 (2007).

Artikel Google Scholar

Kim, DW, Chater, KF, Lee, KJ & Hesketh, A. Auswirkungen der Wachstumsphase und der entwicklungsrelevanten bldA-spezifizierten tRNA auf das membranassoziierte Proteom von Streptomyces coelicolor. Mikrobiol. (Lies.) 151, 2707–2720 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Chandra, G. & Chater, KF Evolutionärer Fluss potenziell bldA-abhängiger Streptomyces-Gene, die das seltene Leucin-Codon TTA enthalten. Antonie Van. Leeuwenhoek 94, 111–126 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Guyet, A. et al. Identifizierte Mitglieder des AdpA-Regulons von Streptomyces lividans, die an der Differenzierung und dem Sekundärstoffwechsel beteiligt sind. BMC Microbiol 14, 81 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

White, J. & Bibb, M. bldA-Abhängigkeit der Undecylprodigiosin-Produktion in Streptomyces coelicolor A3(2) beinhaltet eine signalwegspezifische Regulierungskaskade. J. Bakteriol. 179, 627–633 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ericson, CF et al. Ein kontraktiles Injektionssystem stimuliert die Metamorphose des Röhrenwurms durch die Verlagerung eines proteinhaltigen Effektors. Elife 8, https://doi.org/10.7554/eLife.46845 (2019).

Rocchi, I. et al. Eine bakterielle Phagenschwanzstruktur tötet eukaryotische Zellen durch Injektion eines Nukleaseeffektors. Cell Rep. 28, 295–301 e294 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sayers, EW et al. Datenbankressourcen des National Center for Biotechnology Information. Nukleinsäuren Res. 49, D10–D17 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Soding, J., Biegert, A. & Lupas, AN Der interaktive HHpred-Server zur Proteinhomologieerkennung und Strukturvorhersage. Nucleic Acids Res 33, W244–W248 (2005).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Casu, B., Sallmen, JW, Schlimpert, S. & Pilhofer, M. Zytoplasmatische kontraktile Injektionssysteme vermitteln den Zelltod in Streptomyces. bioRxiv, 2022.2008.2009.503279, https://doi.org/10.1101/2022.08.09.503279 (2022).

Habann, M. et al. Listeria-Phage A511, ein Modell für die kontraktile Schwanzmaschinerie von SPO1-verwandten Bakteriophagen. Mol. Microbiol 92, 84–99 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yague, P. et al. Die transkriptomische Analyse von flüssigen, nicht sporulierenden Kulturen von Streptomyces coelicolor zeigt die Existenz einer komplexen Differenzierung, die mit der in festen sporulierenden Kulturen vergleichbar ist. PLoS One 9, e86296 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manteca, A., Jung, HR, Schwammle, V., Jensen, ON & Sanchez, J. Quantitative Proteomanalyse von Streptomyces coelicolor Nichtsporulierende Flüssigkulturen zeigen einen komplexen Differenzierungsprozess, der mit dem in sporulierenden Festkulturen vergleichbar ist. J. Proteome Res. 9, 4801–4811 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tenconi, E., Traxler, MF, Hoebreck, C., van Wezel, GP & Rigali, S. Die Produktion von Prodigininen ist Teil eines programmierten Zelltodprozesses in Streptomyces coelicolor. Front Microbiol 9, 1742 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Miguelez, EM, Hardisson, C. & Manzanal, MB Hyphentod während der Kolonieentwicklung in Streptomyces antibioticus: morphologischer Beweis für die Existenz eines Prozesses der Zelllöschung in einem mehrzelligen Prokaryoten. J. Cell Biol. 145, 515–525 (1999).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manteca, A., Fernandez, M. & Sanchez, J. Zytologische und biochemische Beweise für einen frühen Zellabbau in Oberflächenkulturen von Streptomyces antibioticus. Res Microbiol 157, 143–152 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wildermuth, H. Entwicklung und Organisation des Luftmyzels in Streptomyces coelicolor. J. Gen. Microbiol 60, 43–50 (1970).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Filippova, SN & Vinogradova, KA Programmierter Zelltod als eines der Stadien der Streptomycetendifferenzierung. Mikrobiologie 86, 439–454 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Mendez, C., Brana, AF, Manzanal, MB & Hardisson, C. Rolle des Substratmyzels bei der Kolonieentwicklung in Streptomyces. Dürfen. J. Microbiol 31, 446–450 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chater, KF Streptomyces Inside-Out: eine neue Perspektive auf die Bakterien, die uns mit Antibiotika versorgen. Philos. Trans. R. Soc. London. B Biol. Wissenschaft. 361, 761–768 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bibb, MJ, Domonkos, A., Chandra, G. & Buttner, MJ Die Expression der hydrophoben Hüllproteine Chaplin und Rodlin in Streptomyces venezuelae wird durch Sigma (BldN) und einen verwandten Anti-Sigma-Faktor, RsbN, kontrolliert. Mol. Microbiol 84, 1033–1049 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gust, B., Challis, GL, Fowler, K., Kieser, T. & Chater, KF PCR-gezielter Streptomyces-Genersatz identifiziert eine Proteindomäne, die für die Biosynthese des Sesquiterpen-Bodengeruchs Geosmin benötigt wird. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 100, 1541–1546 (2003).

Hobbs, G., Frazer, CM, Gardner, DCJ, Cullum, JA & Oliver, SG Verteiltes Wachstum von Streptomyces in Flüssigkultur. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 31, 272–277 (1989).

Artikel CAS Google Scholar

Redenbach, M. et al. Eine Reihe geordneter Cosmide und eine detaillierte genetische und physikalische Karte für das 8 MB große Streptomyces coelicolor A3(2)-Chromosom. Mol. Microbiol 21, 77–96 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kieser, T. et al. Praktische Streptomyces-Genetik. (John Innes Foundation, 2000).

Edgar, RC MUSCLE: Mehrfachsequenz-Alignment mit hoher Genauigkeit und hohem Durchsatz. Nukleinsäuren Res. 32, 1792–1797 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waterhouse, AM, Procter, JB, Martin, DM, Clamp, M. & Barton, GJ Jalview Version 2 – ein Editor für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen und eine Analyse-Workbench. Bioinformatik 25, 1189–1191 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Die Autoren möchten Robert Flick vom BioZone Centre for Applied Bioscience and Bioengineering an der University of Toronto und Dr. Leanne Wybenga-Groot vom SPARC BioCentre, The Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada, für ihre Unterstützung bei der Massenspektrometrie-Datenanalyse danken. Die Autoren danken Avi Odenheimer für die Unterstützung bei der Bildbearbeitung und Illustrationen. MV wurde durch ein Connaught International Doctoral Scholarship unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Discovery Grants an ARD (RGPIN-201) und JRN (RGPIN-2021-03861) vom Natural Sciences and Engineering Research Council (Kanada) unterstützt.

Abteilung für Biochemie, University of Toronto, Toronto, Ontario, Kanada

Maria Vladimirov, Stefanie Mak, Justin R. Nodwell und Alan R. Davidson

Abteilung für Molekulargenetik, University of Toronto, Toronto, Ontario, Kanada

Ruo Xi Zhang & Alan R. Davidson

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MV hat die meisten der vorgestellten Experimente konzipiert und durchgeführt. RXZ führte einige der eCIS-Partikelreinigungen und Inter-Arten-Abtötungstests durch. SM half bei der Durchführung von Experimenten mit S. coelicolor. JRN sorgte für die Betreuung, Beratung und Bearbeitung des Manuskripts. Die ARD betreute das Projekt. MV und ARD haben das Papier verfasst.

Korrespondenz mit Alan R. Davidson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Vladimirov, M., Zhang, RX, Mak, S. et al. Für den entwicklungsgesteuerten Zelltod bei Streptomyces coelicolor ist ein kontraktiles Injektionssystem erforderlich. Nat Commun 14, 1469 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37087-7

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 28. Februar 2023

Veröffentlicht: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37087-7

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