Untersuchung der vertikalen und horizontalen Übertragung von Spiroplasmen in Zecken unter Laborbedingungen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13265 (2023) Diesen Artikel zitieren

233 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Viele Arthropoden beherbergen bakterielle Symbionten, die durch vertikale und/oder horizontale Übertragung aufrechterhalten werden. Spiroplasma ist einer der bekanntesten Symbionten von Zecken und anderen Arthropoden. Es ist immer noch unklar, wie sich Spiroplasma-Infektionen in Zeckenpopulationen ausgebreitet haben, obwohl sie bei einigen Zeckenarten häufig vorkommen. In dieser Studie wurde Ixodes ovatus, von dem berichtet wurde, dass es bei hohen Frequenzen Spiroplasma ixodetis beherbergt, unter experimentellen Bedingungen auf sein vertikales Übertragungspotential untersucht. Als nächstes wurden zwei Isolate von aus Zecken stammendem Spiroplasma, S. ixodetis und Spiroplasma mirum, experimentell in Spiroplasma-freie Haemaphysalis longicornis-Kolonien geimpft und das Vorhandensein von Spiroplasma in ihren Eiern und Larven getestet. Unsere experimentellen Daten bestätigten, dass S. ixodetis im ursprünglichen Wirt I. ovatus vertikal auf Eier und Larven übertragen wurde. Im zweiten Experiment gab es keinen signifikanten Unterschied im Vollgewicht, im Eigewicht und in der Schlupfrate zwischen den mit Spiroplasma inokulierten und den Kontrollgruppen mit H. longicornis. Dies deutet darauf hin, dass eine Spiroplasma-Infektion die Zeckenreproduktion nicht beeinträchtigt. Spiroplasma-DNA wurde nur in den Eiern und Larven einiger Individuen der mit S. ixodetis inokulierten Gruppen nachgewiesen. Dies hat das Potenzial einer horizontalen Übertragung zwischen verschiedenen Zeckenarten gezeigt. Diese Erkenntnisse könnten dazu beitragen, die Übertragungsdynamik von Spiroplasma in der Natur und seinen Anpassungsmechanismus an Wirtsarthropodenarten zu verstehen.

Ixodid-Zecken sind blutsaugende Ektoparasiten von Wirbeltieren, von denen weltweit etwa 700 Arten verbreitet sind1. Sie dienen als Überträger für viele Krankheitserreger und verursachen weltweit erhebliche Probleme im Bereich der öffentlichen Gesundheit und des Veterinärwesens2,3. Ixodid-Zecken heften sich tage- oder wochenlang an ihren Wirt, während sie sich von dessen Blut ernähren. Abhängig von der Anzahl der Wirte, die sie während ihres Lebenszyklus befallen, werden sie in ein-, zwei- und dreiwirtige Zecken eingeteilt. Einwirt-Zecken heften sich während ihres Lebenszyklus an einen einzelnen Wirt, während sich Zwei- und Dreiwirt-Zecken nach der Nahrungsaufnahme vom Wirt lösen, um sich in der Umgebung zwischen den Stadien zu häuten4,5,6,7,8.

Der Begriff „Symbiose“ wurde erstmals 1879 definiert, um den Zustand zu beschreiben, bei dem verschiedene Arten in enger Verbindung zusammenleben9. Symbiotische Beziehungen sind in biologischen Prozessen und Ökosystemen wichtig10. In der Natur sind symbiotische Beziehungen zwischen Bakterien und Arthropoden gut bekannt und wurden ausführlich untersucht10. Symbionten nutzen unterschiedliche Übertragungsstrategien, um ihr Überleben in ihren Wirten zu ermöglichen11. Einige Symbionten wie Wolbachia und Arsenophonus werden vertikal in Wirtsarthropoden übertragen12. In der Zwischenzeit nutzen andere horizontale Übertragungswege, indem sie beispielsweise von in der Umwelt lebenden oder infizierten Artgenossen oder anderen Arten erworben werden13,14. In einigen Fällen führt eine Kombination mehrerer Infektionswege zu komplexen Übertragungsdynamiken in der Natur15,16. Die vorherrschende Übertragungsform von Endosymbionten ist die vertikale Übertragung, die hauptsächlich von der Mutter auf die Nachkommen erfolgt17. Einige Insektensymbionten zeigen spezielle Übertragungsstrategien, beispielsweise über elterliche Sekrete nach der Eiablage18.

Mitglieder der Gattung Spiroplasma sind spiralförmige Bakterien, denen Zellwände fehlen. Es wird geschätzt, dass 5–10 % der Arthropoden Spiroplasmen als Symbionten beherbergen19,20. Viele Spiroplasma-Arten halten ihre Infektion in ihren Wirten durch vertikale Übertragung aufrecht21. Bei Drosophila nutzt Spiroplasma eine Dotteraufnahmemaschinerie, um zur vertikalen Übertragung in die Keimbahn zu gelangen22. Kürzlich wurde festgestellt, dass einige dieser vertikal übertragenen Spiroplasmen ihren Wirten Schutz gegen Nematoden, Schlupfwespen und Pilze verleihen21. Obwohl bei einigen Arten eine vertikale Übertragung von Spiroplasmen bestätigt wurde21, haben phylogenetische Studien eine schlechte Häufung von Spiroplasmen, auch von derselben Wirtsart, berichtet. Dies deutet darauf hin, dass eine horizontale Übertragung zwischen nicht verwandten Wirten häufig erfolgt21,23,24.

Zecken beherbergen im Allgemeinen mütterlicherseits vererbte bakterielle Endosymbionten25,26. Einige dieser Endosymbionten, wie Coxiella und Francisella, sind wahrscheinlich für den Lebenszyklus von Zecken essentiell27. Es wurde auch gezeigt, dass Zecken Spiroplasmen beherbergen28,29. Wie sich eine Spiroplasma-Infektion unter Zeckenpopulationen ausbreitet, ist immer noch unklar, obwohl bei einigen Zeckenarten wie Ixodes ovatus und Haemaphysalis kitaokai hohe Infektionsraten beobachtet wurden30.

In dieser Studie wurde die vertikale Übertragung von Spiroplasma anhand von vor Ort gesammelten I. ovatus nachgewiesen, die Spiroplasma bei hoher Frequenz beherbergen. Darüber hinaus wurde das horizontale Übertragungspotenzial von Spiroplasma untersucht, indem aus Zecken isolierte Spiroplasma-Stämme experimentell in Spiroplasma-freie Laborzeckenkolonien inokuliert wurden.

Von 30 I. ovatus-Weibchen (die zuvor mit Männchen gepaart wurden), mit denen Kaninchen befallen wurden, waren 14 Zecken acht Tage nach dem Befall vollständig angeschwollen und lösten sich von den Tieren. Neun von ihnen legten etwa neun Tage nach der Ablösung Eier, während bei fünf vollgestopften Zecken keine Eiablage beobachtet wurde.

DNA, die aus drei Eierpools und drei Larvenpools pro Zecke extrahiert wurde, wurde zum Nachweis von Spiroplasma mittels PCR und Sanger-Sequenzierung verwendet. Spiroplasma ixodetis-DNA wurde in allen getesteten Ei- und Larvenpools nachgewiesen. Eine Spiroplasma-Infektion wurde auch bei allen geschwollenen I. ovatus-Weibchen bestätigt, von denen die getesteten Eier und Larven stammten.

Weibchen von H. longicornis wurden entweder PBS, S. ixodetis oder S. mirum mit oder ohne Antibiotika (Penicillin-G-Natriumsalz) injiziert. Von 70 verwendeten Zecken waren nach der Injektion insgesamt 63 Zecken am Leben. Während der Inkubationszeit sieben Tage nach der Injektion waren sieben Zecken tot. Das durchschnittliche Milchstaugewicht wurde für 3–7 Personen in jeder Gruppe berechnet und lag im Bereich von 87,4–262,2 mg. Das größte Anschwellungsgewicht wurde für die Injektionsgruppe S. ixodetis (5 × 1011 Bakterien) + Penicillin-G-Natriumsalz beobachtet (Abb. 1, S. ixodetis H_PG). Am kleinsten war die Injektionsgruppe mit S. mirum (5 × 1011 Bakterien) (Abb. 1, S. mirum H_wo). Beim Kruskal-Wallis-Test gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede im Anschwellungsgewicht zwischen den Gruppen, einschließlich der Gruppen mit und ohne Antibiotika (Abb. 1). Die Eierproduktionseffizienz wurde berechnet als das Gewicht der gelegten Eier dividiert durch das Körpergewicht im geschwollenen Zustand31. Der für 3–7 Personen in jeder Gruppe berechnete Durchschnitt lag im Bereich von 33,1–57,1. Die höchste Eierproduktionseffizienz wurde in der Injektionsgruppe mit S. mirum (5 × 108 Bakterien) beobachtet (Tabelle 1, SM_Low_wo), während die niedrigste in der Injektionsgruppe mit S. ixodetis (5 × 1011 Bakterien) beobachtet wurde (Tabelle 1, SI_High_wo). ). Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Eierproduktionseffizienz zwischen den Gruppen, einschließlich derjenigen mit und ohne Antibiotika. Die Schlupfrate wurde für 3–7 Individuen in jeder Gruppe berechnet und lag im Bereich von 3,5–98,8 %. Die höchste mittlere Schlupfrate wurde für die S. ixodetis-Injektionsgruppe (5 × 108 Bakterien) beobachtet (Tabelle 1, SI_Low_wo). Unterdessen wurde der niedrigste Wert für die S. mirum (5 × 1011 Bakterien) + Penicillin-G-Natriumsalz-Injektionsgruppe beobachtet (Tabelle 1, SM_High_PG). Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Schlupfrate zwischen den Gruppen, einschließlich derjenigen mit und ohne Antibiotika (Abb. 1, Tabelle 1).

Angeschwollenes Gewicht der Zecken nach den experimentellen Impfungen. PBS_PG ist PBS + Penicillin-G-Natriumsalz. H_wo ist 5 × 1011 Bakterien. H_PG besteht aus 5 × 1011 Bakterien + Penicillin-G-Natriumsalz. L_wo beträgt 5 × 108 Bakterien. L_PG besteht aus 5 × 108 Bakterien + Penicillin-G-Natriumsalz. Der weiße Kreis in der Abbildung stellt das durchschnittliche Vollgewicht dar. Der schwarze Kreis in der Abbildung stellt jeden Wert dar.

Das Vorhandensein von Spiroplasma in den Eiern wurde mittels PCR anhand von drei Eipools pro Zecke getestet. Insgesamt Eierpools von zwei Zecken, bestehend aus jeweils drei Pools in der S. ixodetis (5 × 1011 Bakterien)-Injektionsgruppe und einer Zecke (zwei Pools) in der S. ixodetis (5 × 1011 Bakterien) + Penicillin G-Natriumsalz-Injektionsgruppe waren positiv für eine Spiroplasma-Infektion (Tabelle 1). Der Rest der Gruppen wurde mittels Spiroplasma-spezifischer PCR negativ getestet. In keiner der S. mirum-Injektionsgruppen wurde Spiroplasma nachgewiesen.

Das Vorhandensein von Spiroplasma in den Larven wurde mittels PCR mit drei Larvenpools pro einzelner Zecke getestet. Insgesamt Larvenpools von zwei Zecken, bestehend aus jeweils drei Pools in der S. ixodetis (5 × 1011 Bakterien)-Injektionsgruppe und einer Zecke (zwei Pools) in der S. ixodetis (5 × 1011 Bakterien) + Penicillin-G-Natriumsalz-Injektionsgruppe waren positiv für eine Spiroplasma-Infektion (Tabelle 1). Der Rest der Gruppen war bei der Spiroplasma-spezifischen PCR alle negativ. In keiner der S. mirum-Injektionsgruppen wurde Spiroplasma nachgewiesen.

Spiroplasma wurde als eines der wichtigsten mikrobiellen Taxa im Zeckenmikrobiom identifiziert25. Die Übertragungsdynamik in der Natur ist bei Zecken jedoch noch unbekannt. In dieser Studie wurden vor Ort gesammelte I. ovatus, eine Art, die Spiroplasma in hoher Häufigkeit beherbergt, für den experimentellen Befall unter Laborbedingungen verwendet. Es wurde bestätigt, dass Spiroplasma auf Eier und Larven übertragen wird. Diese Studie lieferte den ersten experimentellen Beweis dafür, dass S. ixodetis in Zecken vertikal übertragen wird.

Zuvor wurde vermutet, dass es unter experimentellen Bedingungen zu einer horizontalen Übertragung von Spiroplasma zwischen Milben und Drosophila (Drosophila nebulosa und Drosophila willistoni) kommen könnte32. Spiroplasma ixodetis wurde bei mehreren Arthropoden nachgewiesen, darunter auch bei einigen Zeckenarten. Die phylogenetische Analyse deutet auf eine horizontale Übertragung zwischen Zecken und anderen Arthropoden hin24. In dieser Studie wurden S. ixodetis und S. mirum experimentell in Spiroplasma-freies H. longicornis inokuliert. Spiroplasma wurde nur in den S. ixodetis-Injektionsgruppen nachgewiesen, nicht jedoch in den S. mirum-Injektionsgruppen (Tabelle 1). Dieses Ergebnis liefert den ersten experimentellen Beweis dafür, dass S. ixodetis in nicht heimischen Zeckenarten erhalten bleiben kann, was das horizontale Übertragungspotenzial von Spiroplasma zwischen verschiedenen Zeckenarten unterstützt. Allerdings könnte die geringere Häufigkeit der Spiroplasma-Übertragung auf die schlechte Anpassung der Isolate an die neue Wirtszeckenart zurückzuführen sein. In andere Arten eingeführte Spiroplasma-Stämme werden bei Drosophila oft nur schlecht von der Mutter auf die Nachkommen übertragen33. Spiroplasma citri, das normalerweise Zikaden infiziert, wächst gut in der Hämolymphe von D. melanogaster, hat jedoch keinen Zugang zur Eizelle und wird daher nicht vertikal übertragen34. Obwohl eine Reihe interspezifischer Übertragungen von Spiroplasma zwischen Drosophila-Arten bestätigt wurden35, wurde die Übertragung von Spiroplasma von Drosophila auf andere Arthropodenarten selten dokumentiert. Es wurde festgestellt, dass die vertikale Übertragungsrate von Spiroplasma bei Drosophila stark von der Temperatur beeinflusst wird36, was darauf hindeutet, dass Umweltfaktoren unter Laborbedingungen, wie z. B. die Temperatur, die Ergebnisse beeinflusst haben könnten.

Spiroplasma poulsonii in Drosophila besiedelt die Eizellen des Wirts in bestimmten Stadien, die mit der Vitellogenese zusammenfallen, und benötigt Mechanismen für den Transport und die Aufnahme des Dotters, um eine effiziente vertikale Übertragung zu erreichen22. Es wurde beobachtet, dass Spiroplasma citri durch rezeptorvermittelte Endozytose in die Speichelzellen der Rübenzikade gelangt37. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Spiroplasma möglicherweise über die allgemeine Fähigkeit verfügt, mit der endozytischen Maschinerie des Wirts zu interagieren, um eine vertikale Übertragung sicherzustellen. Die Aufnahme von Vitellogenin über den Vitellogeninrezeptor in der Eizelle ist ein wesentlicher Vorgang für den Fortschritt der Oogenese bei Zecken, einschließlich H. longicornis38,39. Daher könnte Spiroplasma bei Zecken den gleichen Mechanismus nutzen wie der, der bei anderen Arthropoden beobachtet wurde. Um diese Hypothese weiter zu bestätigen, muss die Lokalisierung von S. ixodetis in I. ovatus nach der Bluternährung bis zur Eiablage geklärt werden.

In dieser Studie wurde Spiroplasma in mehreren Injektionsgruppen mit Antibiotika geimpft. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Vollgewichts, des Eigewichts und der Schlupfrate zwischen der mit Antibiotika behandelten und der nicht behandelten Gruppe beobachtet. Wenn die Symbiontendichte in Wirtsinsekten experimentell mithilfe von Antibiotika verringert wurde, wird die Reproduktionsfähigkeit des Wirts aufgrund der Symbiontensortierung bei vertikaler Übertragung verringert40. In der vorliegenden Studie hatte die Antibiotikabehandlung keinen Einfluss auf die vertikale Übertragung von Spiroplasma bei Zecken. Eine antibiotische Behandlung von Zecken wurde mit mehreren Störungen der Fortpflanzungsfähigkeit in Verbindung gebracht, wie z. B. einer verminderten Eimasse und einem verringerten Eigewicht sowie einer geringeren Schlupfrate. Dies ist auf eine Dysbiose der Mikrobiota und eine Verringerung der Endosymbionten zurückzuführen41,42. In unseren vorläufigen Experimenten starben Zecken, denen 0,5 Einheiten Penicillin-G-Natriumsalz injiziert wurden, innerhalb von 24 Stunden, was auf eine nachteilige Wirkung von Antibiotika auf die Zeckenphysiologie hinweist (Daten nicht gezeigt). Das Fehlen einer ausgeprägten Wirkung der Antibiotikabehandlung im aktuellen Experiment kann teilweise durch die geringere Antibiotikakonzentration erklärt werden, bei der die Mikrobiota in den mit Antibiotika behandelten Gruppen nicht beeinträchtigt wurde. Daher ist es notwendig, die Konzentration und Art der zu verabreichenden Antibiotika sowie die Inokulationswege in Zukunft zu optimieren, um die Wechselwirkung zwischen Spiroplasma und Zeckenmikrobiota zu verstehen.

Ixodes ovatus wurden im Mai 2021 durch Markierung der Vegetation in der Stadt Sapporo, Japan (N 43.02 E 141.29) gesammelt und unter einem Stereomikroskop gemäß den standardmäßigen morphologischen Schlüsseln morphologisch identifiziert43. Vor Ort gesammelte Zecken wurden in Petrischalen überführt und bis zur Verwendung in einem Inkubator bei 16 °C aufbewahrt. Parthenogenetische Laborkolonien des Stammes H. longicornis Okayama (Fujisaki, 1978)44, die am Nationalen Forschungszentrum für Protozoenkrankheiten der Obihiro-Universität für Landwirtschaft und Veterinärmedizin, Japan, gepflegt werden, wurden in Spiroplasma-Infektionsexperimenten verwendet. Vor dem Experiment wurde durch Spiroplasma-spezifische PCR bestätigt, dass diese Zeckenkolonie frei von Spiroplasmen ist.

Weibliche und männliche Zecken wurden eine Woche vor dem Experiment in dieselbe Petrischale gelegt. Dreißig weibliche I. ovatus wurden mit Ohrbeuteln an den Ohren japanischer weißer Kaninchen (Slc: JW/CSK; Japan SLC, Shizuoka, Japan) befestigt. Den angehefteten Zecken wurde erlaubt, sich zu ernähren, bis sie anschwollen und sich auf natürliche Weise ablösten. Die vollgestopften Zecken wurden dann gesammelt und im Dunkeln bei 25 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit zur Eiablage inkubiert (Abb. 2).

Überblick über den experimentellen Ablauf des experimentellen Befalls von im Feld gesammelten Ixodes ovatus bei Kaninchen.

Die Pools von Eiern (n = 10) und Larven (n = 10) wurden von jeder Zecke gesammelt und einer DNA-Extraktion und einer Spiroplasma-spezifischen PCR unterzogen, wie unten beschrieben.

In dieser Studie wurden zwei Spiroplasma-Arten verwendet: S. ixodetis (Stamm 135) und S. mirum (Stamm Q35). Der Spiroplasma ixodetis-Stamm 135 wurde in einer früheren Studie aus männlichen Ixodes monospinosus mithilfe von ISE6-Zellen isoliert45. Das Isolat wurde in ISE6-Zellen gezüchtet, die vom CEH Institute of Virology and Environmental Microbiology (Oxford, UK) mit L-15B-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 5 % Tryptosephosphatbrühe (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), erhalten wurden , USA) bei 32 °C wie zuvor beschrieben30 . Der Spiroplasma mirum-Stamm Q35 wurde aus einem weiblichen Ixodes pavlovsky isoliert, das in der Stadt Urausu, Japan, gesammelt wurde (N 43,46, E 141,76), indem das Zeckenhomogenat mit ISE6-Zellen gemeinsam kultiviert wurde. Die Bakterienspezies wurde durch Amplifikation und Sequenzierung der 16S-rDNA-Sequenz identifiziert, wie zuvor berichtet (unveröffentlicht)45. Das Isolat wurde anschließend mit modifiziertem SP4-Medium bei 32 °C46 kultiviert. Beim Farbumschlag von Rot nach Gelb wurde das Kulturmedium gewechselt. Die Titration von Spiroplasma wurde durch Zählen der Bakterienzellen unter einem Dunkelfeldmikroskop durchgeführt. Die Endkonzentrationen der Spiroplasma-Lösung wurden vor der Inokulation in die Zecken unter Verwendung von Kulturmedien auf 1 × 109 und 1 × 1012 Bakterien/µL eingestellt.

Weibchen von H. longicornis wurden an Objektträgern befestigt und mit einem IM 300-Mikroinjektor (Narishige, Tokio, Japan) durch die vierte Coxae mit 0,5 µl PBS- oder Spiroplasma-Lösung injiziert. Es gab 10 Injektionsgruppen, nämlich die PBS-Gruppen, nur PBS und PBS + Penicillin-G-Natriumsalz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); S. ixodetis-Injektionsgruppen, nur S. ixodetis (5 × 108 Bakterien und 5 × 1011 Bakterien) und S. ixodetis (5 × 108 Bakterien und 5 × 1011 Bakterien) + Penicillin G-Natriumsalz; S. mirum-Injektionsgruppen, nur S. mirum (5 × 108 Bakterien und 5 × 1011 Bakterien) und S. mirum (5 × 108 Bakterien und 5 × 1011 Bakterien) + Penicillin G-Natriumsalz. Die Endkonzentration des Penicillin-G-Natriumsalzes in der Lösung betrug 100 U/ml.

Nach der Inokulation wurden die injizierten Zecken sieben Tage lang bei 25 °C in einem Inkubator belassen. Für den Kaninchenbefall wurden insgesamt 70 Zecken pro Injektionsgruppe an getrennten Ohren japanischer weißer Kaninchen befestigt. Den angehefteten Zecken wurde erlaubt, sich zu ernähren, bis sie anschwollen und sich auf natürliche Weise ablösten. Die vollgestopften Zecken wurden dann gewogen und zur Eiablage im Dunkeln bei 25 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert. Nach der Eiablage wurden die Eier gewogen und unter den gleichen Bedingungen bis zum Schlüpfen inkubiert. Die Schlupfrate wurde berechnet, indem die Anzahl der geschlüpften Larven in den ausgewählten Eierpools gezählt wurde (50–150 Eier/Pool). Drei Pools von Eiern (je 100) und Larven (je 100) jeder Zecke wurden einer DNA-Extraktion und einer Spiroplasma-spezifischen PCR unterzogen (Abb. 3).

Überblick über den experimentellen Ablauf der Spiroplasma-Injektion in Haemaphysalis longicornis-Zecken und deren Befall bei Kaninchen.

Die Eier, Larven und Weibchen nach der Eiablage wurden mit einem BioMasher (Nippi, Tokio, Japan) homogenisiert, wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Genomische DNA wurde aus den Homogenaten mit einem NucleoSpin® DNA Insect Kit (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland) gemäß den Richtlinien des Herstellers extrahiert. Zum Nachweis von Spiroplasma-DNA wurde eine PCR-Amplifikation für 1028 bp 16S-rDNA unter Verwendung der Primer spi_f1 (5′-GGGTGAGTAACACGTATCT-3′) und spi_r3 (5′-CCTTCCTCTAGCTTACACTA-3′)30 durchgeführt. Die PCR wurde in einem 20-μl-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 10 μl 2 × Gflex-PCR-Puffer (Mg2+, dNTP plus) (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan), 400 nM Tks Gflex™ DNA-Polymerase, 400 nM jedes Primers, 1 μL DNA-Vorlage und sterilisiertes Wasser. Die Reaktion wurde 1 Minute lang bei 94 °C durchgeführt, gefolgt von 45 Zyklen bei 10 Sekunden lang bei 98 °C, 30 Sekunden lang bei 60 °C und 45 Sekunden lang bei 68 °C sowie einem letzten Schritt 5 Minuten lang bei 68 °C . PCR-Produkte wurden auf einem 1,0 %igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Die DNA von Spiroplasma-Arten, die in der vorherigen Studie47 aus I. persulcatus isoliert wurden, und sterilisiertes Wasser wurden in jeden PCR-Lauf als Positiv- bzw. Negativkontrolle einbezogen. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden mit dem ExoSAP-IT Express PCR Cleanup Reagent (Thermo Fisher Scientific, Tokio, Japan) gereinigt. Die Sanger-Sequenzierung wurde mit einem BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Sequenzierungsdaten wurden mit der ATGC-Softwareversion 6.0.4 (GENETYX, Tokio, Japan) zusammengestellt.

Alle statistischen Analysen wurden mit Microsoft 365 Excel durchgeführt. Der Kruskal-Wallis-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede im Gewicht der geschwollenen Zecken, im Eigewicht und in der Eischlüpfrate pro Injektionsgruppe zu bestätigen. Zur Erstellung der Diagramme wurde R-Software (Version 4.2.3) verwendet48.

Alle Tierversuche wurden unter der Leitung des Instituts für Labortierforschung (ILAR) durchgeführt, das auf den grundlegenden Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen und damit verbundenen Aktivitäten in akademischen Forschungseinrichtungen im Zuständigkeitsbereich des Ministeriums für Bildung und Kultur basierte , Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan. Dieses Versuchsprotokoll wurde vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen der Universität Hokkaido (Genehmigungsnr. 22-0030) und dem Ausschuss für Tierpflege und -nutzung der Universität für Landwirtschaft und Veterinärmedizin Obihiro (Genehmigungsnr. 18-11, 19-) genehmigt. 74, 20-85 und 21-40). Alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Komitees durchgeführt. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien berichtet.

Diese Studie ist die erste, die experimentell die vertikale Übertragung von S. ixodetis in Zecken unter Verwendung von vor Ort gesammeltem I. ovatus bestätigt. Darüber hinaus wurde Spiroplasma in Eiern und Larven von H. longicornis nachgewiesen, die experimentell mit S. ixodetis inokuliert wurden. Dies weist darauf hin, dass S. ixodetis durch horizontale Übertragung auf nicht heimische Arthropodenarten übertragen werden kann. Weitere Experimente sind erforderlich, um die Lebensfähigkeit des eingeführten Spiroplasmas in den Empfängerwirten und die Wirksamkeit der Übertragung auf die nächste Entwicklungsstufe oder Generation zu bewerten. Diese Erkenntnisse können dabei helfen, die Übertragungsdynamik von Spiroplasma in der Natur, den Anpassungsmechanismus an bestimmte Zeckenarten und letztendlich die Auswirkungen auf die Physiologie der Wirtszecken zu verstehen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Guglielmone, AA et al. Die Argasidae, Ixodidae und Nuttalliellidae (Acari: Ixodida) der Welt: Eine Liste gültiger Artennamen. Zootaxa 2528, 1–28 (2010).

Artikel Google Scholar

Omer, LT, Kadir, MAA, Seitzer, U. & Ahmed, JS Eine Untersuchung von Zecken (Acari: Ixodidae) an Rindern, Schafen und Ziegen im Gouvernement Dohuk, Itraq. Parasit. Res. 101, 179–181 (2007).

Artikel Google Scholar

Brites-neto, J., Duarte, KMR & Martins, TF Durch Zecken übertragene Infektionen bei Menschen und Tieren weltweit. Tierarzt. Welt. 8, 301–315 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sutherst, RW, Wharton, RH & Utech, KBW Leitfaden zu Studien zur Zeckenökologie. Abt. Entomol. Technik. Aufsatz 14, 1–59 (1978).

Google Scholar

Needham, GR & Teel, PD Physiologische Ökologie von Ixodid-Zecken außerhalb des Wirts. Annu. Rev. Entomol. 36, 659–681 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Castro, JJD & Newson, RM Wirtsresistenz bei der Zeckenbekämpfung bei Rindern. Parasit. Heute 9, 13–17 (1993).

Artikel PubMed Google Scholar

Londt, GH & Van Der Bijl, EB Der Lebenszyklus der Zweiwirt-Zecke Rhipicephalus evertsi evertsi Neumann, 1897, unter Laborbedingungen (Acarina: Ixodidae). Onderstepoort J. Vet. Res. 44, 21–28 (1977).

CAS PubMed Google Scholar

Leal, B., Zamora, E., Fuentes, A., Thomas, DB & Dearth, RK Suche durch Zeckenlarven (Acari: Ixodidae): Ein Überblick über die Einflüsse, die das Überleben außerhalb des Wirts beeinflussen. Ann. Entomol. Soc. Bin. 113, 425–438 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bary, A. de. Die erscheinung der symbiose in Vortrag (ed. Gruyter, de A.) 5–30 (Berlin, 1879).

Brownlie, JC & Johnson, KN Symbionten-vermittelter Schutz in Insektenwirten. Trends. Mikrobiol. 17, 348–354 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ewald, PW Übertragungsmodi und Entwicklung des Parasitismus-Mutualismus-Kontinuums. Ann. NY Acad. Wissenschaft. 503, 295–306 (1987).

Artikel CAS PubMed ADS Google Scholar

Moran, NA, McCutcheon, JP & Nakabachi, A. Genomik und Evolution vererbbarer bakterieller Symbionten. Annu. Rev. Genet. 42, 165–190 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bright, M. & Bulgheresi, S. Eine komplexe Reise: Übertragung mikrobieller Symbionten. Nat. Rev. Microbiol. 8, 218–230 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salem, H., Florez, L., Gerardo, N. & Kaltenpoth, M. Eine außerkörperliche Erfahrung: Die extrazelluläre Dimension für die Übertragung wechselseitiger Bakterien bei Insekten. Proz. R. Soc. B. 282, 2957. https://doi.org/10.1098/rspb.2014.2957 (2015).

Artikel Google Scholar

Ebert, D. Die Epidemiologie und Evolution von Symbionten mit Mixed-Mode-Übertragung. Annu. Rev. Ecol. Entwicklung Syst. 44, 623–643 (2013).

Artikel Google Scholar

Drew, GC et al. Übergänge in der Symbiose: Hinweise auf Umwelterwerb und soziale Übertragung innerhalb einer Gruppe erblicher Symbionten. ISME J. 15, 2956–2968. https://doi.org/10.1038/s41396-021-00977-z (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, JJ, Mihaljevic, JR, Marteaux, LD & Hrček, J. Metacommunity-Theorie zur Übertragung vererbbarer Symbionten innerhalb von Insektengemeinschaften. Ökologisch. Entwicklung 10, 1703–1721 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Kaltenpoth, M., Winter, SA & Kleinhammer, A. Lokalisierung und Übertragungsweg von Coriobacterium glomerans, dem Endosymbionten von Pyrrhocorid-Käfern. FEMS Mikrobiol. Ökologisch. 69, 373–383 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goryacheva, I., Blekhman, A., Andrianov, B., Romanov, D. & Zakharov, I. Spiroplasma-Infektion bei Harmonia axyridis – Diversität und Mehrfachinfektion. Plus eins. 13, e0198190. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198190 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duron, O. et al. Die Vielfalt der Fortpflanzungsparasiten unter Arthropoden: Wolbachia geht nicht alleine. BMC Biol 6, 27. https://doi.org/10.1186/1741-7007-6-27 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ballinger, MJ & Perlman, SJ Das defensive Spiroplasma. Curr. Meinung. Insekt. Wissenschaft. 32, 36–41 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Herren, JK, Paredes, JC, Schüpfer, F. & Lemaitre, B. Vertikale Übertragung eines Drosophila-Endosymbionten durch Kooption der Dottertransport- und Internalisierungsmaschinerie. ASM 4, e00532-12. https://doi.org/10.1128/mBio.00532-12 (2013).

Artikel Google Scholar

Haselkorn, TS, Markow, TA & Moran, NA Mehrfache Einführung des bakteriellen Endosymbionten Spiroplasma in Drosophila. Mol. Ökologisch. 18, 1294–1305 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Binetruy, F. et al. Die Phylogenetik des Endosymbionten Spiroplasma ixodetis enthüllt frühere Übertragungen zwischen Zecken und anderen Arthropoden. Zecken. Tick. Geboren. Dis. 10, 575–584 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Bonnet, SI, Binetruy, F., Hernández-Jarguín, AM & Duron, O. Das Zeckenmikrobiom: Warum nicht-pathogene Mikroorganismen für die Zeckenbiologie und die Übertragung von Krankheitserregern wichtig sind. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 7, 236. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017.00236 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Duron, O. et al. Evolutionäre Veränderungen in der Struktur der Symbiontengemeinschaft bei Zecken. Mol. Ökologisch. 26, 2905–2921 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Duron, O. et al. Der Mutualismus zwischen Zecken und Bakterien hängt von den B-Vitamin-Synthesewegen ab. Curr. Biol. 28, 1896–1902 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tully, JG, Whitcomb, RF, Rose, DL & Bove, JM Spiroplasma mirum, eine neue Art aus der Kaninchenzecke (Haemaphysalis leporispalustris). Int. J. Syst. Bakteriol. 32, 92–100 (1982).

Artikel Google Scholar

Taroura, S. et al. Nachweis der DNA von „Candidatus Mycoplasma haemominutum“ und Spiroplasma sp. in ungefütterten Zecken, die in der Vegetation Japans gesammelt wurden. J. Tierarzt. Med. Wissenschaft. 67, 1277–1279 (2006).

Artikel Google Scholar

Ogata, S. et al. Eine Spiroplasma-Infektion bei Ixodid-Zecken weist eine Artenabhängigkeit auf und deutet auf ein vertikales Übertragungsmuster hin. Mikroorganismen 9, 333. https://doi.org/10.3390/microorganisms9020333 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boldbaatar, D. et al. Mehrere Vitellogenine aus der Zecke Haemaphysalis longicornis sind entscheidend für die Entwicklung der Eierstöcke. J. Insekt. Physiol. 56, 1587–1598 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M. & Minhas, M. Interspezifische Übertragung von endosymbiotischem Spiroplasma durch Milben. Biol. Lette. 3, 23–25 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hutchence, KJ, Padé, R., Swift, HL, Bennett, D. & Hurst, GDD Phänotyp und Übertragungseffizienz künstlicher und natürlicher männlich-tötender Spiroplasma-Infektionen bei Drosophila melanogaster. J. Invertebr. Pathol. 109, 243–247 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Herren, JK & Lemaitre, B. Spiroplasma und Wirtsimmunität: Die Aktivierung humoraler Immunantworten erhöht die Endosymbiontenlast und die Anfälligkeit für bestimmte gramnegative bakterielle Krankheitserreger in Drosophila melanogaster. Zelle. Mikrobiol. 13, 1385–1396 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ikeda, H. Interspezifische Übertragung des „Sex-Ratio“-Erregers von Drosophila willistoni in Drosophila bifasciata und Drosophila melanogaster. Wissenschaft 147, 1147–1148 (1965).

Artikel CAS PubMed ADS Google Scholar

Osaka, R., Nomura, M., Watada, M. & Kageyama, D. Negative Auswirkungen niedriger Temperaturen auf die vertikale Übertragung und Infektionsdichte eines Spiroplasma-Endosymbionten in Drosophila hydei. Curr. Mikrobiol. 57, 335–339 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kwon, MO, Wayadande, AC & Fletcher, J. Bewegung von Spiroplasma citri in den Darm und die Speicheldrüsen seines Zikadenvektors. Zirkulifer Tenellus. APS. 89, 1144–1151 (1999).

CAS Google Scholar

Iii, RDM, Sonenshine, DE & De León, AAP Vitellogenin-Rezeptor als Ziel für die Zeckenbekämpfung: Eine Kurzübersicht. Vorderseite. Physiol. 10, 618. https://doi.org/10.3389/fphys.2019.00618 (2019).

Artikel Google Scholar

Mihara, R., Umemiya-shirafuji, R., Abe, Y. & Matsuo, T. Die Entwicklung von Eizellen im Eierstock einer parthenogenetischen Zecke. Haemaphysalis longicornis. Parasit. Int. 67, 465–471 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Koga, R., Tsuchida, T., Sakurai, M. & Fukatsu, T. Selektive Eliminierung von Blattlaus-Endosymbionten: Auswirkungen der Antibiotikadosis und des Wirtsgenotyps sowie Konsequenzen für die Fitness. FEMS Mikrobiol. Ökologisch. 60, 229–239 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhong, J., Jasinskas, A. & Barbour, AG Die Antibiotikabehandlung des Zeckenüberträgers Amblyomma americanum verringerte die Fortpflanzungsfähigkeit. PLoS One 2, e405. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000405 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Li, LH, Zhang, Y. & Zhu, D. Auswirkungen einer Antibiotikabehandlung auf die Fruchtbarkeit von Rhipicephalus haemaphysaloides-Zecken. Parasit. Vektoren. 11, 242. https://doi.org/10.1186/s13071-018-2807-7 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamaguti, N., Tipton, VJ, Keegan, HL & Toshioka, S. Zecken aus Japan, Korea und den Ryukyu-Inseln. Brigham Young Univ. Wissenschaft. Stier. Biol. Ser. 15, 1–226 (1971).

Google Scholar

Umemiya-Shirafuji, R. et al. Harte Zecken als Forschungsressourcen für die Vektorbiologie: Vom Genom bis zur Ganzkörperebene. Med. Entomol. Zool. 70, 181–188 (2019).

Artikel Google Scholar

Thu, MJ et al. Isolierung von Rickettsia, Rickettsiella und Spiroplasma aus suchenden Zecken in Japan mithilfe von Arthropodenzellen. Vektor. Geboren. Zoonotisch. Dis. 19, 474–485 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Whitcomb, RF Kulturmedien für Spiroplasmen. In Methods in Mycoplasmology V1: Mycoplasma Characterization (Hrsg. Razin, S. & Tully, JG) 147–159 (Elsevier, 1983).

Kapitel Google Scholar

Qiu, Y., Nakao, R., Ohnuma, A., Kawamori, F. & Sugimoto, C. Mikrobielle Populationsanalyse der Speicheldrüsen von Zecken; eine mögliche Strategie zur Überwachung bakterieller Krankheitserreger. PLoS One 9, e103961. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103961 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Fox, J. & Weisberg, S. Das ggplot2-Paket. In An R Companion to Applied Regression 3. Auflage (Hrsg. Salmon, H.) 469–471 (Sage Publications, 2019).

Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir möchten allen Mitarbeitern danken, die die Probensammlung unterstützt haben. Diese Forschung wurde von JSPS KAKENHI (19H03118, 20K21358, 20KK0151 und 22H02505), dem Japan Program for Infectious Diseases Research and Infrastructure (21fk0108614j0001) der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) und Cooperative Research Grant(29-) unterstützt. Gelenk-1, 30-Gelenk-13, 2020-Gelenk-1, 2021-Gelenk-1 und 2022-Gelenk-12) des National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine.

Labor für Parasitologie, Abteilung für Krankheitskontrolle, Graduiertenschule für Infektionskrankheiten, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Hokkaido, Sapporo, 060-0818, Japan

Shohei Ogata, Kodai Kusakisako, Keita Kakisaka, Elisha Chatanga, Naoki Hayashi, Yurie Taya, Yuma Ohari, Gita Sadaula Pandey, Abdelbaset Eweda Abdelbaset, Nariaki Nonaka und Ryo Nakao

Labor für molekulare zielgerichtete Therapeutika, School of Pharmacy, Nihon University, Chiba, 274-8555, Japan

Shohei Ogata

Abteilung für internationale Forschungsförderung, International Institute for Zoonosis Control, Universität Hokkaido, Sapporo, 001-0020, Japan

Shohei Ogata & Yongjin Qiu

Nationales Forschungszentrum für Protozoenkrankheiten, Universität für Landwirtschaft und Veterinärmedizin Obihiro, Obihiro, 080-8555, Japan

Rika Umemiya-Shirafuji

Labor für Veterinärparasitologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Kitasato-Universität, Towada, 034-8628, Japan

Kodai Kusakisako

Abteilung für Veterinärpathobiologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Lilongwe University of Agriculture and Natural Resources, PO Box 219, Lilongwe, Malawi

Elisa Es hat begonnen

Fakultät für Veterinärmedizin, Rakuno-Gakuen-Universität, Ebetsu, 069-8501, Japan

Yuma Ohari

Abteilung für Tiermedizin, klinische Labordiagnostik, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Assiut, Assiut, 71515, Ägypten

Abdelbaset Eweda Abdelbaset

Abteilung für Virologie I, Nationales Institut für Infektionskrankheiten, Shinjuku-ku, Tokio, 162-8640, Japan

Yongjin Qiu

Managementabteilung für Biosicherheit, Labortier- und Pathogenbank, Nationales Institut für Infektionskrankheiten, Shinjuku-ku, Tokio, 162-8640, Japan

Yongjin Qiu

Abteilung für Risikoanalyse und -management, International Institute for Zoonosis Control, Universität Hokkaido, Sapporo, 001-0020, Japan

Keita Matsuno

One Health Research Center, Universität Hokkaido, Sapporo, 001-0020, Japan

Keita Matsuno

International Collaboration Unit, International Institute for Zoonosis Control, Universität Hokkaido, Sapporo, 001-0020, Japan

Keita Matsuno

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung, SO; Datenkuration, RUS, KK und NN; Formale Analyse, EC, NH und YO; Untersuchung, SO, YT, GSP, AEA und YQ; Methodik, RUS, KM und RN; Projektverwaltung, RUS und RN; Finanzierungsakquise, RN; Ressourcen, RUS und NR; Software, KM; Aufsicht, RN; Visualisierung, SO; Schreiben-Originalentwurf, SO; Schreiben-Rezension und Bearbeitung, RUS, KK, KK, EC, NH, YT, YO, YQ, KM, NN und RN Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Ryo Nakao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ogata, S., Umemiya-Shirafuji, R., Kusakisako, K. et al. Untersuchung der vertikalen und horizontalen Übertragung von Spiroplasmen in Zecken unter Laborbedingungen. Sci Rep 13, 13265 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39128-z

Zitat herunterladen

Eingegangen: 01. Mai 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 15. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39128-z

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.